Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Определение нитратов в кормах, крови, молоке и патологическом материале с использованием реактива Грисса. Принцип. Метод основан на извлечении нитратов из проб дистиллированной водой, восстановлении их до нитритов металлическим цинком в растворе уксусной кислоты и взаимодействии последних с реактивом Грисса с образованием азосоединения розово-красного цвета. Реакция специфична для нитратов. Чувствительность определения 40 мкг нитрат-ионов в пробе.
Реактивы: сульфаниловая кислота (ч. д. а.);
1-нафтиламин (сс-нафтиламин, ч. д. а.);
уксусная кислота концентрированная (х. ч.);
калия нитрат (KNO3, х. ч.);
цинковая пыль;
марганца сульфат (ч. д. а.);
реактив Грисса: а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты; б) 0,1 г а-нафтила-мина растворяют при нагревании в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты. Растворы «а» и «б» хранят отдельно в холодильнике в течение 2 мес. Перед употреблением их смешивают 1:1;
калибровочный раствор калия нитрата основной. Растворяют 1,630 г калия нитрата, высушенного до постоянной массы при 105 °С в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 л и доводят
240
объем раствора до метки дистиллированной водой. 1 мл этого раствора содержит 1 мг нитрат-ионов (NO3). Хранят в холодильнике в течение 3 мес;
рабочий калибровочный раствор калия нитрата. В мерную колбу на 100 мл переносят 20 мл калибровочного раствора калия нитрата и доводят объем до метки дистиллированной водой. 1 мл этого раствора содержит 0,2 мг (200 мкг) нитрат-ионов (NO3). Готовят перед анализом.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; химические пробирки; пипетки на 1, 5, 10, 20 мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл; конические колбы; химические стаканы; цилиндры на 10, 50 и 100 мл; мешочки или пленка для диализа.
Ход определения. Для исследования берут 10 г измельченного растительного или патологического материала, такое же количество гепаринизированной крови (молока). Извлечение нитратов из проб крови, молока, патологического материала и кормов, дающих при извлечении окрашенные растворы, проводят методом диализа. Для этого измельченные пробы (сухие пробы предварительно смачивают) помещают в мешочки или пленку для диализа и погружают в стаканчики или колбы с 50 мл дистиллированной воды на 2 ч. Затем диализат фильтруют в калиброванный сосуд, а мешочек с пробой еще раз погружают в 20 мл дистиллированной воды на 30 мин в тот же сосуд. Затем мешочки с пробами вынимают, диализат фильтруют и объединяют с первым, доводя его объем до 100 мл. 6 мл диализата отбирают в пробирку для анализа на нитраты. При малом содержании нитратов в пробе диализат концентрируют до небольшого объема, фильтруют его, измеряют объем и берут 6 мл для анализа.
Для извлечения нитратов из проб растительного материала, образующих неокрашенные растворы, измельченные пробы помещают в конические колбы и наливают 50 мл дистиллированной воды. Извлечение проводят 1 ч, часто встряхивая колбы. Затем раствор фильтруют, пробу еще раз смывают 20—30 мл дистиллированной водой и объединяют с первой частью фильтрата, пропуская через тот же фильтр. Далее поступают так же, как описано выше.
В пробирку с 6 мл анализируемого фильтрата приливают 2 мл 10%-ной уксусной кислоты и вносят на кончике скальпеля смесь цинковой пыли с марганца сульфатом (Ir цинковой пыли предварительно тщательно перемешивают со 100 г марганца сульфата). Пробирку встряхивают 30 с. Затем приливают 1 мл реактива Грисса, перемешивают содержимое пробирки и через 10 мин колориметрируют иа ФЭКе при длине волны 536 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против дистиллированной воды. Оптическую плотность окрашенного раствора оп-
'6 — 4196
241
ределяют только при наличии прозрачного и бесцветного фильтрата.
Расчет ведут по калибровочной кривой. Для составления шкалы стандартов в 8 химических пробирок наливают рабочий раствор в количестве, указанном в таблице 38.
38. Приготовление стандартных растворов
№ пробирки
Калибровочный раствор калия нитрата рабочий, мл
Вода дистиллированная, мл
Содержание NOf1 мг
№ пробирки
Калибровочный раствор калия нитрата рабочий, мл
Вода дистиллированная, мл
Содержание NO3- , мг
1
0,0
6,0
0,00
5
1,0
5,0
0,2
2
0,2
5,8
0,04
6
1,5
4,5
0,3
3
0,3
5,7
0,06
7
2,0
4,0
0,4
4
0,5
5,5
0,10
8
3,0
2,0
0,6
В каждую из пробирок приливают по 2 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и вносят на кончике скальпеля (не более 30 мг) цинковую пыль с марганца сульфатом. Далее проводят все операции так же, как описано для опытных проб.
Для построения калибровочной кривой определяют оптическую плотность растворов в 8 пробирках так же, как при определении опытных проб.
Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мг), а на оси ординат — найденные значения оптической плотности растворов.
Расчет ведут по формуле
Vx В 1000
где X — содержание нитратов (нитрат-ионов), мг/кг; К; — общий объем фильтрата, мл; В — содержание нитрат-ионов, найденное по калибровочной кривой, мг; 1000 — коэффициент для пересчета на 1 кг; V2 — объем фильтрата, взятый для анализа, мл; H — масса навески анализируемого образца, г.
