Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Ход определения. Кинетический метод. В кювету длиной 1 см, термостатированную при 37 °С, помещают 1,2 мл субстратно-буферного раствора, предварительно приведенного к 37 °С. Затем вводят 0,1 мл сыворотки или плазмы крови, перемешивают и начинают отсчет времени. Измеряют оптическую плотность раствора при 400—430 нм (Hg 405 нм) против воды в течение 1—5 мин после старта.
Для калибровочной пробы 0,1 мл стандартного раствора и-нит-роанилина (содержимое ампулы) доводят дистиллированной водой до 5 мл. Измеряют оптическую плотность раствора в условиях, аналогичных опытной пробе.
Расчет активности у-глутамилтранспептидазы ведут по формулам
х = 21660?^ или
x = 77,98-^, А
где x — активность фермента, нмоль/сл или мкмоль/ч • мл; 21660 — коэффициент для перевода в нмоль/с • л; 77,98 — коэффициент для перевода в мкмоль/ч - л; VA — разность экстинкций опытной пробы в пересчете на 1 мин инкубации; А — экстинкция калибровочной пробы.
Метод постоянного времени. В пробирку вносят 1 мл субстратно-буферного раствора, приведенного к температуре 37 °С, и приливают 0,1 мл сыворотки или плазмы крови. Содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 мин при 37 °С. Затем добавляют 6 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и перемешивают.
Холостую пробу ставят так же, как и опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.
Измеряют экстинкцию опытной пробы против холостой при длине волны 400—430 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Активность у-глутамилтранспептидазы определяют по калибровочному графику. Для построения его из стандартного раствора л-нитроанилина (содержимое ампулы) готовят разведения в соответствии с таблицей 37.
238
37. Разведения л-нитроанилииа для построения калибровочного графика
№
пробирки
Стандартный раствор л-нитроанили-на, мл
Дистиллированная вода, мл
Активность фермента
нмоль/с • л
мкмоль/ч • мл
1
0,1
0,9
550
1,98
2
0,2
0,8
1100
3,96
3
0,4
0,6
2200
7,92
4
0,8
0,2
4400
15,84
5
1,0
—
5500
19,80
В пробирке отмеривают по 0,1 мл полученных растворов, добавляют по 7 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, перемешивают и фотометрируют против воды в условиях, аналогичных опытной пробе. Строят график зависимости оптической плотности раствора от активности фермента.
Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/с • л.
Клиническое значение. Активность фермента в сыворотке крови повышается при гепатобилиарных заболеваниях, болезнях поджелудочной железы, диабете. Наиболее высокая активность ГГТ (ГГФ) отмечается при закупорке желчных протоков и других холестических состояниях, а также при вовлечении печени в злокачественный процесс, когда без признаков желтухи активность фермента возрастает в 10—15 раз. При хроническом гепатите активность ГГФ повышается в несколько раз. ГГФ особенно чувствительна к гепатотоксическим воздействиям. Определение активности ГГТ (ГГФ) — наиболее чувствительный скрининговый тест на заболевание печени, который предпочтительнее определения трансамиаз или щелочной фосфатазы.
По данным Н. В. Утеченко (2003), активность ГГТ в сыворотке крови телят при токсической гепатодистрофии составляла 1103,0 (+118,4) - 2393,0 (+417) нкат/л при норме 150,0 (+30,0) нкат/л. Примечания. 1. Методика утверждена Минздравом Украины.
Приказ № 91 от 8.04.1998 г. 2. При активности пробы выше 5000 нмоль/с • л ее разбавляют физиологическим раствором (0,9 % натрия хлорида). Результат умножают на разделение. 3. Активность у-глутамилтранспептидазы не изменяется в течение 7 дней при хранении сыворотки крови при 4 °С и в течение 3 мес при минус 20 °С. 4. В случае использования кюветы с рабочим объемом более 1 мл количество рабочего раствора необходимо пропорционально увеличить. 5. Из всех антикоагулянтов предпочтение отдается ЭДТА. Калия оксалат с натрия фторидом снижают активность ГГТ. 6. В сыворотке крови активность ГГТ выше, чем в плазме. 7. Билирубинемия, гемоглобин, липемия дают ложнозаниженные результаты.
239
3.3.12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ В КОРМАХ, КРОВИ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ
В связи с неравномерным внесением в почву больших доз азотных удобрений возникает возможность накопления в кормах и воде высоких концентраций нитратного и нитритного азота. При поедании таких кормов или использовании воды у животных нарушается обмен веществ, репродуктивная функция и даже возможно отравление.
В системе профилактики нитратного и нитритного токсикоза важное значение имеет систематический контроль за концентрацией нитратов и нитритов в кормах, воде, крови, молоке и других субстратах.
Для определения нитратного и нитритного азота в почве, кормах, воде и биологических субстратах используют фотометрические, ионометрические и другие методы, применяют автоанализаторы проточного типа.
В ветеринарных и зоотехнических лабораториях для определения нитратов и нитритов в кормах, крови и патологическом материале чаще применяют колориметрический метод с использованием реактива Грисса. В последнее время в агрономии, зоотехнике и ветеринарии широко используют ионометрический экспресс-метод определения нитратного азота в почвах, растениях, кормах, природных водах и биологических субстратах.