Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Холостую пробу ставят так же, как и опытную, но вместо раствора аденозиндифосфата натрия добавляют воду.
Для калибровочной пробы 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора аденозиндифосфата, 0,4 мл рабочего раствора креатина обрабатывают так же, как опытную пробу. Измеряют против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо креатина берут воду.
Расчет производят по формуле
х ~ (Еоп ~ Ехол)/(Ек ~ ^хол) ' 333,
233
где X — активность креатинкиназы, нмоль/с • л; E0n — экстинкция опытной пробы; E^0n — экстинкция холостой пробы; E^ — экстинкция калибровочной пробы; 333 — коэффициент пересчета креатинфосфата, преформированного 1 л сыворотки за 1 с на наномоли.
Примечания. 1. Берут свежую свободную от гемолиза кровь или плазму с ЭДТА или гепарином. Образцы крови в лабораторию доставляют как можно скорее. Сыворотку хранят в закрытых пробирках в темноте в течение 2 дней при температуре не выше 20—25 °С. 2. Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови можно проводить унифицированным методом с использованием креатина в качестве субстрата.
Источники: 43, 69.
Клиническое значение. KK катализирует обратимую реакцию фосфорилирования креатина. Повышение активности KK отмечается при повреждении сердечной или скелетных мышц. При повреждении сердечной мышцы ее активность у человека повышается в 20—30 раз по сравнению с нормой, при повреждении скелетных — еще больше.
При определении активности KK в сыворотке крови животных следует сравнивать величины у клинически здоровых и больных животных. Резкое повышение KK очевидно при миоглобинурии, травматическом перикардите, хирургических заболеваниях (травмах). У новорожденных активность KK выше, чем у взрослых.
Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. Принцип. Под действием холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхолинхлорида с образованием уксусной кислоты и холина. Уксусная кислота сдвигает pH буферного раствора, что устанавливается с помощью индикатора по изменению цвета буферного раствора.
Реактивы: 0,9 моль/л раствор ацетилхолинхлорида. 1,63 г ацетилхолинхлорида растворяют в 10 мл дистиллированной воды. При использовании фармакопейного ампулированного препарата содержимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл воды. Раствор хранят в холодильнике. Годен в течение 6—7 дней (из-за гигроскопичности открытую склянку с ацетилхолинхлоридом хранят в эксикаторе);
вероналовый буфер, pH 8,4. 1,5450 г натриевой соли веронала (мединала) растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 9 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты и 150 мл 0,1 г/л раствора индикатора, измеряют pH. Объем доводят дистиллированной водой до 1 л. Буфер хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Годен в течение 1 мес;
индикатор — фиолетовый синий с переходом окраски от желтой к красной в пределах pH 6,8—8,4. 0,1 г сухого индикатора растирают в ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора натрия гидроксида. После растворения объем доводят дистиллированной водой до
234
25 мл. Из полученного 0,4%-ного раствора перед употреблением готовят 0,01%-ный раствор разведением его дистиллированной водой в 40 раз;
0,7%-ный водный раствор прозерина. 0,7 г прозерина растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят в посуде из темного стекла;
0,1 моль/л раствор уксусной кислоты. Готовят из стандарт-титра (фиксанала) или путем доведения дистиллированной водой 5,7 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) до 1000 мл в мерной колбе на 1 л.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; ультратермостат; мерные колбы.
Ход определения. В пробирку вносят 5 мл вероналового буфера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают при температуре 37 °С в течение 5 мин. Затем добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °С. После инкубации добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Экстинкцию измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против воды. Окраска устойчива в течение 1 ч.
Контроль ставят так же, как опыт, но раствор прозерина добавляют до инкубации.
Из экстинкции контрольной (холостой) пробы вычитают экстинкцию опытной. Расчет ведут по калибровочному графику. Активность холинэстеразы выражают в микромолях уксусной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации или в нмоль/с • л. В этом случае полученную величину умножают на коэффициент 0,280.
Для построения калибровочного графика из 0,1 моль/л раствора уксусной кислоты готовят разведения, как указано в таблице 35.
Из каждого разведенного раствора отбирают по 0,2 мл, добавляют 5 мл вероналового буфера и 0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при температуре 37 °С, добавляют 0,2 мл раствора прозерина, 0,2 мл ацетилхолинхлорида. Смесь инкубируют 30 мин при температуре 37 °С, быстро охлаждают. Экстинкцию измеряют при тех же условиях, что и в опытных пробах. Холостую пробу ставят
35. Разведения раствора уксусной кислоты для построения калибровочного графика
