Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
0,9%-ный раствор натрия хлорида, мл
Раствор D-сорбитола, мл
Трис-бу-фер, мл
Раствор ТХУ, мл
Раствор резорцина, мл
30%-ный раствор соляной кислоты, мл
Активность
сдг,
нмоль/с - л
1
0,2 калибро-
0,10
0,1
0,2
0,4
0,1
3,0
55,6
вочного рас-
твора, разве-
денного в
10 раз
0,9%-ным рас-
твором NaCl
2
0,05
0,25
0,1
0,2
0,4
0,1
3,0
139,0
3
0,10
0,20
0,1
0,2
0,4
0,1
3,0
278,0
4
0,20
0,10
0,1
0,2
0,4
0,1
3,0
556,0
5
0,30
—
0,1
0,2
0,4
0,1
3,0
834,0
231
Далее калибровочные пробы помещают в водяную баню при 80 °С на 8 мин, охлаждают и измеряют при тех же условиях, что и опытные пробы, против холостой пробы. В холостую пробу вместо калибровочного раствора добавляют 154 ммоль/л раствор натрия хлорида.
Пересчет активности сорбитолдегидрогеназы на микромоли фруктозы на 1 л сыворотки за 1 с инкубации при 37 °С производят по формуле
С- 1000-3300-2 180-3600
где X — активность сорбитолдегидрогеназы, нмоль/ с-л; С-1000 — количество D-фруктозы в калибровочной пробе, нм; 3300 — коэффициент пересчета на 1 л сыворотки; 2/3600 — коэффициент пересчета на 1 с инкубации; 180 — масса 1 ммоля D-фруктозы, мкг.
Линейная зависимость сохраняется от 0 до 830 нмоль/с • л.
Примечания. 1. Сыворотка должна быть свежей и свободной от гемолиза. 2. Фермент сыворотки термостабилен. Чтобы избежать потери активности фермента, сыворотку рекомендуется хранить при температуре 2-8 °С.
Источник: 43.
Для определения СДГ в сыворотке крови имеется набор реактивов заводского изготовления, в основу которого положен изложенный выше метод.
Клиническое значение. СДГ содержится главным образом в клетках печени. У здоровых животных ее активность в крови не определяется из-за небольшой чувствительности методов. Повышение активности СДГ в сыворотке крови устанавливают при остром гепатите, токсической гепатодистрофии, при обострении хронического гепатита, синдроме цитолиза гепатоцитов.
Определение активности креатинкиназы (KK) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. Принцип. Активность фермента пропорциональна количеству креатина, образующегося в результате ферментационной реакции. Креатин определяется по цветной реакции с а-нафтолом.
Реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан (трис, х. ч.);
магния сульфат (ч. д. а.);
трис-буфер, 0,1 моль/л, pH 7,4, содержащий 0,015 моль/л Mg2+ (в виде MgSO4). 1.2 г триса и 0,180 г MgSO4 помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают водой до метки. Раствор стабилен в течение 1 мес при хранении в холодильнике;
0,012 моль/л раствор креатинфосфата динатриевой соли, pH 7,4. Растворяют 0,044 г креатинфосфата в 10 мл воды. Раствор стабилен 1 нед при хранении в холодильнике;
0,004 моль/л раствор аденазин-5-дифосфорной кислоты натриевой соли, pH 7,4. 0,017 г аденозиндифосфата натрия (мол. масса
232
449) растворяют в 100 мл воды. Раствор стабилен 1 нед при хранении в холодильнике;
50 г/л раствор бария гидроксида восьмиводного (ч. д. а. или х. ч.). 5 г безводного бария гидроксида или 8 г восьмиводного бария гидроксида помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают объем до метки водой, не содержащей CO2;
50 г/л раствор цинка сульфата (ч. д. а., х. ч.). 5 г цинка сульфата помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой, не содержащей CO2;
а-нафтол (1-нафтол, ч. д. а.);
натрия карбонат (ч. д. а.);
натрия гидроксид (ч. д. а.);
10 г/л раствор а-нафтола. 1 г а-нафтола, 16 г натрия карбоната и 6 г натрия гидроксида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки водой. Раствор готовят не ранее чем за 2 ч до использования;
основной раствор диацетила в этиловом спирте. 0,2 мл диаце-тила растворяют в 20 мл этилового спирта;
рабочий 0,5 г/л раствор диацетила. К 1 мл основного раствора приливают 20 мл дистиллированной воды. Реактив хранят в холодильнике;
основной калибровочный раствор креатина. 0,131 г креатина помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают водой до метки;
рабочий калибровочный 150 мкмоль/л раствор креатина. 1,5 мл основного раствора креатина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем водой до метки. Раствор хранят в холодильнике.
Оборудование: спектрофотометр или фотоэлектроколори-метр; мерные колбы; термостат; секундомер.
Ход определения. 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора креатин-фосфата, 0,1 мл сыворотки крови нагревают 5 мин при 37 0C Добавляют 0,3 мл раствора натрия аденозиндифосфата и инкубируют 30 мин при 37 °С. После инкубации добавляют по 0,5 мл растворов бария гидроксида и цинка сульфата, центрифугируют 15 мин при 3000—4000 мин-1. К 1 мл центрифугата добавляют I мл воды, 1 мл раствора а-нафтола, 0,5 мл раствора диацетила. Для развития окраски пробу помещают в термостат на 30 мин. Измеряют при 520 нм (зеленый светофильтр).
