Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Во все пробирки вносят по 2 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин-1. Затем берут 2,5 мл надосадочной жидкости, добавляют 2,5 мл реактива на фосфор, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять 2 ч. Центрифугируют 5 мин при 3000 мин-1.
Фотометрируют пробы и стандарт при длине волны 436 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля. Контроль ставят так же, как опыт, но вместо центрифугата берут 2,5 мл ТХУ и 2 мл дистиллированной воды.
Расчет ведут по формулам
Xi = А\/В • 5 и Xi = AiJB ¦ 5,
где Xi — количество неорганического фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки крови после ее инкубации, мг; Xi — количество неорганического фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки крови до инкубации, мг; Ai — оптическая плотность исследуемой пробы после инкубации; Ai — оптическая плотность испытуемой пробы до инкубации; В — оптическая плотность рабочего стандартного раствора фосфора; 5 — коэффициент (для 5 мг%-ного стандартного раствора фосфора).
Разница в содержании неорганического фосфора до и после инкубации условно обозначается единицами Бодански. По СИ активность фермента выражают в микромолях неорганического фосфора на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С.
= а ¦ 1000 ¦ 4 X 31 ,
где X — активность фермента; а — количество неорганического фосфора, найденное по калибровочному графику, мг; 1000 — пересчет неорганического фосфора в мг; 4 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 31 — масса 1 мкмоля неорганического фосфора, мг.
15*
227
Примечание. Сыворотка не должна быть гемолизированной.
Клиническое значение. Щелочная фосфатаза так же, как и кислая фосфатаза, отщепляет остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. В сыворотке крови может быть фермент из костной ткани, печени, желчных путей, кишечника и других тканей. В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови равна 1,2—5 ед. Бодански или около 0,4—1,4 мкмоль/мл за 1 ч инкубации при 37 °С, или 110—390 нмоль/с • л.
Щелочная фосфатаза не является строго органоспецифическим ферментом. Значительное повышение ее активности отмечают при холангитах, холецистите, желчекаменной болезни, рахите, остео-дистрофии. Несущественные изменения находят при гепатитах, злокачественных новообразованиях, циррозе печени.
Источники: 29, 39.
Примечания. 1. Есть унифицированный метод определения щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу w-нитрофенилфосфата по Бессея—Лоури. Для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Бадански изготовляются наборы реактивов. 2. В герметически закрытой пробирке сыворотку можно хранить 7 дней при комнатной температуре. 3. Умеренный и сильный гемолиз, липемия, билирубинемия завышают результаты. В плазме активность выше, чем в сыворотке. Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея). Принцип, а-амилаза гидролизует расщепление крахмала с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности а-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски концентрации крахмала.
Реактивы: бензойная кислота (ч. д. а. или х. ч.); натрия фосфат двузамещенный безводный (NaHPO4, ч. д. а.); крахмал растворимый для нефелометрии или крахмал по Lintner. Крахмал по Lintner выпускают зарубежные фирмы специально для использования в качестве субстрата при определении а-амилазы;
154 ммоль/л раствор натрия хлорида;
субстратно-буферный раствор pH 7. 13,3 г безводного двузаме-щенного натрия фосфата и 2,0 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл 154 ммоль/л раствора натрия хлорида и доводят до кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крахмала (крахмал для колориметрии) в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипящий буферный раствор. Кипятят 1 мин, охлаждают и доводят объем дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен при комнатной
228
температуре в течение 10—12 дней. Субстратно-буферный раствор должен быть прозрачным;
калия йодид (ч. д. а. или х. ч.);
калия фторид (ч. д. а.);
калий йодноватокислый (ч. д. а., х. ч.);
кислота хлористоводородная (HCl) концентрированная (х. ч.);
0,01 н. раствор йода. 0,036 г калия йодноватокислого и 0,45 г калия йодида растворяют в 40 мл воды и медленно при помешивании добавляют 0,09 мл концентрированной HCl. 5 г калия фторида растворяют в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, приливают 40 мл раствора йода и доливают водой до 100 мл. Хранят в посуде из темного стекла. Годен в течение 1 мес. Если в рабочий раствор йода не добавляют калия фторид, то его необходимо готовить ежедневно.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; пробирки, пипетки; мерные колбы; секундомер.
Материал для исследования: светлая сыворотка или плазма крови; моча; дуоденальное содержимое, предварительно разбавленное 154 ммоль/л раствором натрия хлорида.
Ход определения. 5 мл субстратно-буферного раствора вносят в колбу на 50 мл, нагревают 5 мин при 37 °С, добавляют 0,1 мл сыворотки, профильтрованной мочи или дуоденального содержимого (предварительно разведенного 154 ммоль/л раствором натрия хлорида в 100 раз). Инкубируют 7,5 мин при 37 °С. Время инкубации следует строго отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 5 мл 0,1 н. раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 50 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) против воды.
