Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
В целях диагностики различных заболеваний используют показатели активности десятков ферментов и их изоферментов. В клинической практике часто определяют активность аспартатаминотранс-феразы (AcAT), аланинаминотрансферазы (АлАТ), лактатдегидроге-назы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), глутаматдегидрогеназы (ГлДГ), аргиназы, уракиназы, гистидазы, алкогольдегидрогеназы, ци-тохромоксидазы, амилазы, сорбитолдегидрогеназы и многих других.
Определение активности AcAT и АлАТ в сыворотке крови динит-рофенилгидрозоновым методом (Рейтмана—Френкеля). Принцип. В результате переаминирования, происходящего под действием AcAT и АлАТ, образуется щавелевоуксусная и пировиног-радная кислоты. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При добавлении 2,4-динитрофенилгидрозина в щелочной среде образуется окрашенный гидрозон пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.
P е а кт и в ы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4. 14,2 г натрия форфата двузамещенного (Na2HPO4 • 2H2O) и 13,6 г калия фосфата однозамещенного (KH2PO4) доводят каждый в отдельности до 1 л дистиллированной водой. Натрий фосфат двузамещенный, содержащий две молекулы воды, получают путем двухсуточного выветривания на воздухе кристаллической соли (х. ч.), содержащей обычно 12 молекул воды. Соль предварительно растирают в ступке в порошок. Для получения буферного раствора pH 7,4 смешивают 840 мл 0,1 моль/л раствора Na2HPO4 • 2H2O и 160 мл 0,1 моль/л раствора KH2PO4. Величину pH буфера доводят под контролем pH-метра. Полученный раствор с индикатором бромтимоловым синим должен давать голубую окраску. К приготовленному раствору в качестве консерванта можно добавить 5—10 мл хлороформа;
0,04%-ный раствор бромтимолового синего. 100 мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл 0,05 моль/л раствором натрия гидроксида. После растворения смывают водой в мерную колбу на 250 мл и доводят объем водой до метки;
субстратный раствор для определения аспартатаминотрансфе-разы. 29,2 мг ос-кетоглютаровой кислоты и 2,66 г DL-аспарагино-вой кислоты (или 1,33 г L-аспарагиновой кислоты) отвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 моль/л раствора натрия гидроксида, который следует прибавлять осторожно, небольшими порциями до полного растворения составных частей и до получения pH 7,4. Раствор приливают количественно в мерную колбу на 100 мл, ополаскивая 0,1 моль/л фосфатным буфером, pH 7,4. Доливают буфер в колбу до метки, тщательно перемешивают, прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют в холодиль-
221
нике в замороженном виде. Перед употреблением раствор полностью оттаивают;
субстратный раствор для определения аланинаминотрансфера-зы. 29,2 мг гх-кетоглютаминовой кислоты и 1,78 г DL-аланина (или 0,89 г L-аланина) отвешивают на аналитических весах. Дальнейшая работа, как и с предыдущим реактивом;
раствор 2,4-динитрофенилгидрозина. 19,8 мг реактива растирают в небольшом количестве 1 моль/л раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После того как раствор остынет, доводят объем соляной кислотой до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике. Годен в течение 1 года;
0,4 моль/л раствор натрия гидроксида, свободный от карбонатов. Бутыли с реактивом и дистиллированной водой закрывают пробками с поглотительными трубками, наполненными натронной известью или бария гидроксидом;
калибровочный раствор натрия пирувата (СНзСОСОСЖа). 11 мг кристаллического натрия пирувата (белого цвета) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки водой. 1 мл раствора содержит ПО мкг натрия пирувата, что соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; весы аналитические; термостат.
Ход определения AcAT. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения AcAT, нагревают при температуре 37 "С в течение 5 мин, добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют при 37 °С 60 мин. Затем добавляют 0,5 мл 2,4-динитрофе-нилгидрозинового раствора и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют 5 мл 0,4 моль/л натрия гидроксида, тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 мин при комнатной температуре. Измеряют на ФЭКе при 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.
Холостую пробу ставят, как опыт, но сыворотку добавляют после инкубации.
Ход определения АлАТ. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АлАТ и нагревают при температуре 37 °С в течение 5 мин. Затем вносят 0,1 мл сыворотки и ставят в термостат при 37 °С на 30 мин. Дальнейший ход анализа осуществляют так же, как и при определении AcAT.
Расчет активности ферментов в сыворотке крови проводят по калибровочному графику.
Из калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице 32.
Калибровочные пробы ставят так же, как опытные, но вместо сыворотки добавляют разведенные калибровочные растворы. Из-
