Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
процессе, например, необходимо допустить следующие этапы: присоединение
переносимого вещества с одной стороны мембраны, транслокацию на другую
сторону, изменение сродства и высвобождение.
На схеме Е и Е' - это формы с разным сродством; стрелкой ¦ Q ^ обозначена
транслокация, - изменение сродства (эти две
ступени могут быть и объединены).
В реакции гидролиза можно выделить следующие ступени: присоединение
субстрата, фосфорилирование, высвобождение АДФ и дефосфорилирование
(порядок последних двух ступеней может быть и обратным).
Е5
| ^АДФ
ЕР
Даже для этих несложных схем возможны различные способы сопряжения. Нашей
целью является установление истинной схемы путем постепенного усложнения
простых вариантов с учетом экспериментального материала. Для Na, К-
АТФазы, например, известно, что транспорт натрия сопряжен с
фосфорилированием, а транспорт калия с дефосфорилированием. Вероятно
допустить, что ассоциация- диссоциация ионов с обеих сторон мембраны
происходит в равновесных условиях, энергия потребляется в процессе
транслокации и изменения сродства, а эти стадии являются сравнительно
медленными и лимитирующими скорость реакции. При построении схемы удобно
использовать также допущение, что продукты реакции отсутствуют, т. е.
рассматривать начальные скорости. В этом случае некоторые ступени можно
считать необратимыми, что также облегчает вывод уравнения.
Когда в транспортном процессе участвует два вещества, возникает
дополнительная сложность из-за того, что возможны разные варианты
сопряжения. Для транспорта Na+ и К+, например, возможен как
одновременный, так и последовательный перенос. К тому же механизм
переноса может быть унитарным (т. е. в процессе участвуют одни и те же
участки (Na-участки переходят в К-участ-ки и наоборот) или бинарным (для
Na+ и К+ существуют отдельные системы переноса). При этом в бинарном
механизме перенос может быть и одновременным, и последовательным, а в
унитарном механизме одновременное связывание ионов Na+ и К+ исключается.
Последнее эквивалентно двухсубстратному пинг-понг-механизму:
Na+ Hah K*;i
20*
Бинарный механизм можно описывать схемой:
Оказалось, что обнаружить различия между этими схемами только на основе
классической кинетики не удается (J. Robinson, М. Flashner, 1979), так
что необходимы какие-то новые приемы. В последующих главах будут изложены
основные принципы анализа кинетических кривых и показано применение этих
методов для исследования зависимости Na, К-АТФазной активности от
субстрата и ионов К+ и Na+. Принципы построения минимальной модели Na, К-
АТФазы могут быть успешно применены при исследовании других транспортных
АТФаз и вообще для систем мембранного транспорта.
Линейная кинетика
2.1. Уравнение Михаэлиса- Ментен
Во многих учебниках, в том числе таких популярных, как "Основы
ферментативной кинетики" А. Корниш-Боуден и "Ферменты" М. Диксона и Э.
Уэбба, высказана мысль о том, что основное количество ферментов
подчиняется кинетике Михаэлиса - Ментен. Несмотря на то что в настоящее
время такое представление является спорным (С. Hill et al., 1977) и
данная книга посвящена изучению ферментов, не подчиняющихся линейной
кинетике, все же целесообразно коротко рассмотреть теорию Михаэлиса.
Центральной идеей всех концепций о механизме действия ферментов является
представление о фермент-субстратном комплексе. Теория Михаэлиса и Ментен,
предложенная еще в 1913 г., основана на двух предпосылках.
1. Взаимодействие между ферментом и субстратом является равновесным:
Реакция распада комплекса практически не влияет на равновесие. Это
условие выполняется, если скорость распада комплекса ES на свободный
фермент и субстрат значительно больше скорости его распада до свободного
фермента и продуктов P(&_i^A+2).
2. Концентрация свободного субстрата остается практически постоянной в
течение начального периода реакции, так что концентрацию субстрата (5)
можно считать равной полной концентрации субстрата (S/). Это условие
обычно выполняется, если полная концентрация субстрата значительно
превышает концентрацию свободного фермента.
Определяя скорость реакции через скорость распада фермент-субстратного
комплекса, нетрудно получить следующее уравнение:
где Ks=k-\/k+\ - константа диссоциации фермент-субстратного
(2.1)
22
комплекса, величина k+2e= V^max - максимальная скорость реакции,
достигаемой в условиях, когда 5 становится большим по сравнению с Ks-
Учитывая, что каталитическая активность ферментов может быть достаточно
большой, Дж. Бриггс и Дж. Холдейн (1925) предложили анализ кинетики
реакций, в которых скорости образования и распада комплекса ES
практически равны, поэтому концентрация комшекса ES остается,'постоянной
в течение определенного промежутка времени, т. е. d[f:5]/d/==0 (принцип
стационарности). При таком допущении для реакции:
E+StLES+P ' , (2.3)
можно получить:
с= *±2?------------. (2.4)
k + l
Если ввести обозначения ". Ушах - &4-2С, Km-{k- I ^4-2 )/&+!" тогда
