Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
д 2,49 2,49 0.09 7,62
е 2.5 2,5 0.1 7,7
ж 1,9 1.1 1.1 7,62
Рис. 28. Расчет степенного параметра ту. I - зависимость v от у(К+) при
различных фиксированных концентрациях S. А. М (мМ), [NaCl]= 10 мМ, pH
6,2; II - зависимость взвешенной квадратичной ошибки (MU) от параметра г:
SAM
а
б
1.9
2.5
1.0
0.5
1.0
3.5
у, ммоль
95
Авторы попытались также определить параметр ту для зависимости v=f(y).
Оказалось, однако, что начиная со значения г= =ту=2 взвешенная
квадратичная ошибка MU практически не изменилась (рис. 28). При этом
увеличить рабочую область концентрации К+ или уменьшить содержание Na+ не
удалось, так как резко возрастала относительная ошибка измерения (около
20-40%). Таким образом, точно параметр ту не определен, но несмотря на
это можно утверждать, что для функции v=f(y) ту^2. Это хорошо видно из
рис. 28, где приведены результаты опытов в двух режимах: с избытком
свободного Mg2+ и с избытком обоих свободных лигандов А и М. Аналогичный
результат был получен и в других условиях реакционной среды.
Если условно принять, что ту=2, тогда, суммируя вышеизложенное, можно
считать, что зависимость v=f(y) имеет следующий вид:
р'
2 "У
прих>1 ;
2 еУ
1-0
р"
у! 2 а"у' при Х<1 V---qir-----•
2 fa'
/-о
6.4. Минимальная модель Na, К-АТФазы
Прежде чем приступить к построению кинетической схемы фермента,
необходимо обратить внимание на некоторые важные факты, которые требуется
учитывать при создании модели.
После того как непосредственно было показано существование
окклюдированных форм фермента, т. е. форм, связываясь с которыми ионы
Mg2+ и К+ уже не могут свободно обмениваться с ионами из внутри- или
внеклеточной среды (М. Esmann, J. Skou, 1985;
I. Glunn et al., 1984), стало ясно, что транслокацию ионов Na и К+
обеспечивают следующие последовательности ступеней:
¦j + Nat
N°i АДФ °
EtS -- NgE1 S (Na)EiP NaEzP Z^1E2P
fo Ф" S' *i
e2pz, 4 г ke2p : ". (k)ezo ^ K K,S
где S - концентрация MgATO комплекса, (Na)EjP и (K)E2P - окклюдированные
формы фермента. EiS-форма фермента должна
96
иметь высокое сродство к Na+ и относительно низкое сродство к К+ (с
внутренней стороны), тогда как ?2^-форма должна иметь высокое сродство к
К+ и относительно низкое сродство к Na+. Ясно, что принципиальная схема
должна отражать именно такие циклы транслокации катионов, включающих
смену окклюдированных состояний и резкое изменение сродства к
транспортируемым катионам. Следует заметить, что ступени (Na^i-P-*-*-
(Na)^^1 и (K)E20+-+- (KJ^iS сопровождаются конформационными изменениями
фермента и, по-видимому, лимитируют суммарную скорость реакции.
При разработке принципиальной схемы необходимо исходить из
экспериментально установленного правила, что связывание фермента с
физиологическими лигандами (Na+, К+, Mg2+, АТФ, MgATO, АДФ и Фн)
индуцирует определенные конформационные изменения (P. Jorgensen, 1982;
Karlish et al., 1984; J. Robinson, 1974). Существуют "гибридные" формы с
различными комбинациями связанных лигандов. Все эти формы четко
отличаются друг от друга своими свойствами и функциональным назначением в
Na, К-АТФазном цикле. Среди них следует выделить несколько групп,
которые, видимо, являются интермедиатами Na, К-АТФазной системы.
Первую группу составляют Na-формы дефосфорилированного фермента. Их
принято обозначать через Е\. К этой группе относятся формы (Na+)?i0,
Е1АТФ, Т^Л^АТФ, (NaJ )2?iMgAT(r) и т. д. Эта группа характеризуется высоким
сродством к нуклеотидам и Na+ и сравнительно низким сродством к К+.
Вторую группу представляют К-формы дефосфорилированного фермента. Их
принято обозначать через Е2. К этой группе относят-
ся форма (Кш )Е20, Е2АТФ, (Кт ^Л^АТФ, ?'2MgATФ и т. д. Эта
группа характеризуется сравнительно низким сродством к нуклеотидам и Na+
и высоким сродством к К+. Показано, что в /^-форме ионы калия
окклюдированы.
Между формами Е\ и Е2 существует равновесие:
К третьей группе относятся фосфорилированные формы фермента Е\Р, которые
отличаются от других АДФ-чувствительным дефосфорилированием. Показано,
что в этой форме ионы Na+ окклюдированы.
К четвертой группе относятся фосфорилированные формы фермента Е2Р,
которые характеризуются К+-чувствительным дефос-форилированием и высоким
сродством к ионам К+ с внешней стороны.
Л/я* АТФ , МдАТФ
97
Кроме вышеперечисленных форм фермента без всякого сомнения должна
существовать свободная, не связанная с лигандами форма. Эта форма прямым
способом не идентифицирована, но имеются веские, хотя и косвенные
доказательства ее существования (J. Jensen et al., 1984).
При разработке принципиальной схемы работы Na, К-АТФазной системы
необходимо определить роль ионов Mg2+ как мощного модификатора системы.
Не вызывает сомнения, что существует Mg-форма фермента, которая
отличается от Na- и К-форм и является интермедиатом системы. Необходимо
объяснить, почему свободные ионы Mg2+: а) тормозят связывание
негидролизуемых аналогов АТФ; б) увеличивают /Со,5 для натрия как
