Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
Остерману (1985) с тем, чтобы, по возможности, выделить фракцию,
содержащую
25
чистый антиген. Однако, хотя при иммуноэлектрофорезе фракций, полученных
при разделении суммарного белка на сефадексах G100, G75 и G50 было
установлено, что антиген выходит в первом пике, интересующий нас антиген
элюировался с колонки одновременно с рядом других белков (рис. 7).
Рис. 9. Выделение в иммунохимически чистом виде антигена с ОЭП 0.35 из
проростков озимой ржи. А-Схема отбора фракций при элюировании с колонки с
сефадексом G100 фракции 3050% насыщения сульфатом аммония белка
проростков озимой ржи. Б-Иммуноэлектрофореграммы фракций белка проростков
озимой ржи. Проявление сыворотками на белки: А-трехсуточных проростков и
Б-одномесячных растений озимой пшеницы.
1- фракция 1; 2- фракция 2;
3-фракция 3.
В то же время было установлено, что при фракционном высаливании белков
трехсуточных проростков озимой ржи сульфатом аммония антиген с ОЭП 0.35
выпадает в осадок при насыщении раствора сульфатом аммония от 30 до 50%
(рис. 8). Однако при этом также преципитирует ряд других белков. При
комбинировании этих двух способов частичной
26
очистки белка, при которой на первой стадии очистки белки трехсуточных
проростков озимой ржи фракционировались сульфатом аммония, а на второй
стадии очистки фракция белков, выпадающих в осадок при насыщении раствора
сульфатом аммония 30-50%, разделялась на колонке с сефадексом G100 на ряд
пи ков, при помощи теста на наличие во фракции антигена с ОЭП 0.35 было
установлено, что интересующий нас антиген выходит в первом пике в
иммунохимичес ки чистом виде (рис. 9) (Колесниченко и др., 1996).
Рис. 10. Электрофореграмма антигена с ОЭП 0.35 из проростков озимой ржи.
1 - анализируемый белок, 2 - маркеры.
Рис. 11. Электрофореграмма полипептидов антигена с ОЭП 0.35 из проростков
озимой ржи. 1 -анализируемый белок, 2 - маркеры.
27
После препаративной наработки часть белка была использована для
установления его молекулярной массы. Электрофорез в ПААГе нативного белка
также показал, что белок очищен в достаточной степени (рис. 10), и
позволил определить молекулярную массу белка с ОЭП 0.35 из проростков
озимой ржи, которая оказалась равной 310 кДа. При электрофорезе в
присутствии ДДС-Na в ПААГе (Laemmli, 1970) этого белка было установлено,
что он состоит из двух типов субъединиц с молекулярными массами 66 и 56
кДа (рис.
11) (Колесниченко и др., 1996).
Очищенный белок проростков ржи с молекулярной массой 310 кДа был
использован для получения специфической поликлональной антисыворотки на
стрессовый белок 310 кДа.
5 ВЛИЯНИЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА С МОЛ. МАССОЙ
310 КДА У ОЗИМЫХ ЗЛАКОВ
Поскольку была получена сыворотка против стрессового белка с молекулярной
массой 310 кДа, а такой иммунохимический метод, как рокет-
иммуноэлектрофорез, позволяет достаточно точно сравнить количественное
содержание исследуемых антигенов, то было проведено количественное
изучение влияния низкотемпературного стресса различной длительности и
интенсивности на содержание данного стрессового белка в
цитоплазматических водорастворимых белках озимой ржи и озимой пшеницы.
Но, прежде всего, требовалось установить, происходит ли в условиях
низкотемпературного стресса синтез субъединиц данного стрессового белка
de novo, или его изменение происходит за счет ассоциации его субъединиц.
Для выяснения того, как влияет часовая гипотермия на синтез de novo белка
с мол. массой 310 кДа, было проведено определение уровня синтеза этого
белка во время гипотермии путем измерения уровня включения радиоактивной
метки в растворимые цитоплазматические белки трехсуточных проростков
озимой пшеницы сорта "Заларинка".
28
Введение радиоактивной метки (14С-лейцин) в белки "контрольных" растений
(при температуре 20°С) проводили в течение 1 часа, в белки
стрессированных (при температуре 20С) растений проводили в течение
полутора часов ввиду того, что, как известно, гипотермия приводит к
значительному ингибированию белкового синтеза у озимой пшеницы (Колоша и
др., 1978; Карасев и др., 1992). Выделение растительного белка проводили
по стандартной схеме. Для каждого варианта опыта определяли концентрацию
и радиоактивность белка в растворе.
Выделенный растворимый цитоплазматический белок из трехсуточных
"контрольных" и стрессированных растений использовали для определения
относительного содержания белка с молекулярной массой 310 кДа и
определения уровня включения радиоактивной метки как в "общий" белок, так
и в белок 310 кДа.
Сравнение при помощи рокет-иммуноэлектрофореза относительного содержания
стрессового белка с молекулярной массой 310 кДа в "контрольных" и
стрессированных проростках показало, что 1.5 часовая гипотермия вызывает
увеличение содержания этого белка до 140% к контролю (рис.
12) (Колесниченко и др., 1997).
Изучение включения метки в белки "контрольных" проростков и проростков,
подвергнутых действию гипотермии, проводилось путем измерения включения
