Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
первой мере электрофореза разделение проводили в геле агарозы, а
разделение во второй мере проводили в градиенте пористости
полиакриламидного геля, было отмечено увеличение содержания белков с
молекулярными массами 610 кДа (ОЭП 0.47) и 310 кДа (ОЭП 0.30) в белках
стрессированных растений. Однако в то же время увеличивалось содержание и
ряда других белков с ОЭП около 0.30 (рис. 4). Таким образом, двумерный
иммуноэлектрофорез не позволил с достаточной уверенностью определить
молекулярную массу антигена с ОЭП 0.30.
Рис. 5. Электрофоретические спектры нативных белков озимой пшеницы (1) и
озимой ржи (2). Цифрами указаны мол. массы белков (кДа).
97-94
22
Интересные данные были получены при сравнении электрофоретических
спектров нативных белков трехсуточных проростков озимой ржи (сорт Чулпан)
и озимой пшеницы (сорт Альбидум 114). На фотографии видно, что спектры
белков трехсуточных проростков озимой ржи и пшеницы сильно различаются
(рис. 5). Если у озимой ржи в спектре нативных белков имеются мощные
полосы белков с молекулярными массами 470 кДа, 310 кДа, 160 кДа, 97 кДа и
94 кДа, то у пшеницы в спектре преобладали белки с молекулярными массами
490 кДа, 280 кДа, 240 кДа, 160 кДа, 97 кДа и 94 кДа. При этом в спектре
полоса белка с молекулярной массой 160 кДа была значительно более сильно
выражена у озимой пшеницы, а белка с молекулярной массой 97 кДа - у
озимой ржи. Эти данные представляют определенный интерес в связи с тем,
что, как было отмечено выше, при использовании иммунохимических методов
больших различий между белками трехсуточных проростков озимых ржи и
пшеницы отмечено не было. Единственным возможным объяснением этому факту
является то, что, несмотря на различия в молекулярных массах, нативные
белки пшеницы и ржи составлены из иммунохимически родственных субъединиц
и имеют одинаковые антигенные детерминанты.
4 ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИГЕНА С О ЭП 0.30
4.1 Изучение возрастных изменений в содержании антигена с ОЭП 0.30 у
незакаленных растений озимой пшеницыг Как известно, многие стрессовые
белки (в частности, белки LEA - дегидрины, молекулярные шапероны и др.)
синтезируются на определенных этапах развития растения конститутивно. В
связи с этим представляло определенный интерес изучение возрастных
особенностей синтеза антигенов озимой ржи с ОЭП 0.35 и озимой пшеницы с
ОЭП 0.30. При помощи иммунохимических методов было установлено, что
содержание этих антигенов, относительно высокое у
23
трехсуточных проростков озимой ржи и озимой пшеницы, снижается с
возрастом и у одномесячных незакаленных растений падает до очень низкого,
практически нулевого уровня (рис. 6). Это обстоятельство позволило
разработать тест для определения наличия антигена с ОЭП 0.35 (у пшеницы -
0.30) при фракционировании белков пшеницы и ржи, когда белки, разделенные
электрофорезом в агарозе, проявляли одновременно сывороткой на белки
трехсуточных проростков и сывороткой на белки одномесячных растений
пшеницы. О наличии этого антигена в данной фракции судили по образованию
дуги преципитации в зоне с ОЭП 0.35 с первой сывороткой и одновременному
отсутствию дуги преципитации в этой зоне подвижности со второй
сывороткой.
Рис. 6.
Иммуноэлектрофоре-грамма суммарного белка трехсуточных проростков (1)и
одномесячных незакаленных растений (2) озимой ржи.
В гель внесена сыворотка на антиген с ОЭП 0.30.
В дальнейшем этот тест на наличие во фракции антигена с ОЭП 0.35 был
использован при выделении данного антигена в иммунохимически чистом виде.
4.2 Выгделение, очистка и определение характеристик антигена с
ОЭП 0.35 из проростков озимой ржи.
Полученные при помощи электрофореза в градиенте ПААГ данные все же не
позволяли с полной уверенностью установить молекулярную массу антигена с
ОЭП 0.30. Для того, чтобы однозначно быть в этом уверенным, необходимо
было выделить этот белок в иммунохимически чистом виде и затем определить
его молекулярную массу при помощи электрофореза.
24
Рис. 7. Иммуноэлектро-фореграммы фракций белка проростков озимой ржи
после разделения на колонках с сефадексами G 150, G 100, G 75 и G 50
(элюент - 0.05 М бикарбонат аммония).
А- профиль элюции белка с колонки;Б-
иммуноэлектро-фореграммы фракций белка:
1- первая выходящая с колонки фракция белка;
2- вторая фракция белка. Проявление сыворотками на белки:
А- трехсуточных проростков;
Б- одномесячных растений озимой пшеницы.
1 2 * 3 4 5 6 7
Рис. 8. Фракционирование белков озимой ржи сульфатом аммония.
Белок выделен из трехсуточных проростков озимой ржи и осажден сульфатом
аммония различной концентрации. В гель внесена сыворотка на антиген с ОЭП
0.35. Белок окрашен Кумасси R-250. Использован сульфат аммония в
следующих концентрациях:
10-20% (1); 20-30% (2); 30-40% (3); 40-50% (4); 50-60% (5); 60-80% (6)
насыщения; 7- суммарный белок.
Для этого было проведено фракционирование суммарного растительного белка
на колонках с сефадексами различных номеров (G150, G100, G75 и G50) по
