Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
только 8% от скорости поглощения кислорода в состоянии 4, в то время ка к
последующее добавление АА полностью ингибировало дыхание (рис. 66, 2).
Интересно отметить, что и в прямом, и в реципрокном э кспериментах, при
функционировании второго комплекса основной транспорт эле ктронов
происходил по цитохромному пути дыхательной цепи митохондрий через
комплекс III, транспорт же электронов через альтернативную о ксидазу был
незначительным.
Основываясь на результатах этих экспериментов, можно предположить, что
остаточное поглощение кислорода в митохондриях озимой пшеницы зависит не
только от транспорта электронов через комплекс I, но и от транспорта
электронов через комплекс IV (поскольку транспорт электронов полностью
блокировался не только добавлением антисыворотки против БХШ 310, но и
KCN). Пос коль ку эти результаты получены в присутствии в среде инкубации
митохондрий антимицина А, то нами было выдвинуто предположение о
существовании альтернативного пути переноса эле ктронов между комплексами
I и IV.
Чтобы проверить это предположение, нами был проведен модельный э
ксперимент с добавлением БХШ 310 к изолированным митохондриям гороха, в
белковом спектре которого, как по казано ранее (Grabelnych et al.,
2001с), отсутствуют субъединицы БХШ 310. Оказалось, что добавление к ним
в состоянии 4 БХШ 310 вызывало 40% увеличение с корости поглощения
кислорода (рис. 67). Это увеличение с корости поглощения кислорода не
ингибировалось последовательными добавлениями
173
антимицина А и БГК, но полностью ингибировалось добавлением антисыворотки
против БХШ 310 или KCN. Та ким образом, можно сделать вывод, что в ходе
этого эксперимента в митохондриях гороха создавалась дополнительная
электронтранспортная цепь, в ключающая в себя БХШ 310 и аналогичная цепи,
существующей в митохондриях озимой пшеницы.
Рис. 67. Влияние ингибиторов дыхательной цепи на скорость поглощения
кислорода в состоянии 4 в митохондриях гороха, инкубируемых в присутствии
БХШ 310 (0,5 мг/мг митохондриального белка). Субстрат окисления: 10 мМ
малат + 10 мМ глутамат. M±m, n=6-12. Ингибиторы добавлены: в
последовательности слева направо. Концентрации
ингибиторов: 20 мкМ антимицин А (АА), 1 мМ БГК и 1 мг/мл антисыворотки
против БХШ 310 (анти-310).
В то же время все имеющиеся в настоящее время данные у казывают на то,
что разобщение, вызываемое БХШ 310 ингибируется добавлением KCN, который
блокирует фун кционирование комплекса IV. Этот фа кт позволяет
предполагать, что, наряду с комплексом I, фун кционирование
174
БХШ 310 связано и с комплексом IV. Так как активность БХШ 310 не
блокируется антимицином А, мы полагаем, что данный белок переносит
электроны на мобильный переносчик цитохром с, вызывая его восстановление.
Чтобы проверить это предположение необходимо было в модельном
эксперименте in vitro установить возможность БХШ 310 восстанавливать
окисленный цитохром с. Полученные данные по казали, что стрессовая форма
БХШ 310 действительно обладает способностью восстанавливать окисленный
цитохром с.
0.1
0,2
рн
Рис. 68. Изменение оптической плотности (dOD) окисленного цитохрома с (50
мкМ) в присутствии БХШ 310 при различных значениях pH. Концентрация
добавленного БХШ 310 составляла 1.25 мг/мл. Длина волны1 550 нм.
Изменение степени восстановления цитохром с определяли
спектрофотометрически по изменению оптической плотности препарата при 550
нм. Используя широкий диапазон значений рН буфера (2.0-9.5), было
установлено, что способность данного белка восстанавливать о кисленный
цитохром с зависит от значения рН реа кционной среды. В
175
диапазонах pH 2.0-3.0 и 7.5-9.5 БХШ 310 не был способен восстанавливать
окисленный цитохром с (рис. 68). Начиная со значения pH 3.0 было отмечено
постепенное увеличение оптичес кой плотности, ма ксимальная величина
которого достигала при pH 6.0 (рис. 68). Затем с увеличением pH эффект
действия БХШ 310 рез ко снижался и после значения рН 7.5 совсем исчезал
(рис. 68).
Рис. 69. Восстановление окисленного цитохрома с (30 мкМ) в зависимости от
концентрации БХШ 310 при рН 6.0. Длина волны 550 нм.
Следующей задачей было изучение влияния концентраций БХШ 310 и цитохрома
с в среде на хара ктер реа кции. Изучение зависимости восстановления
цитохрома с от концентрации БХШ 310 в условиях in vitro выявило, что при
повышении концентрации добавленного БХШ 310 происходило увеличение
степени восстановления цитохрома с, которое носило линейный хара ктер.
Следует заметить, что при минимальной концентрации БХШ 310 (0.125-0.25
мг/мл) восстановления окисленного цитохрома с почти не происходило, в то
время ка к при концентрациях БХШ 310 выше 0.5 мг/мл восстановление
цитохрома с было более интенсивным (рис. 69).
176
Для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация БХШ 310, равная
1.25 мг/мл. На рис. 70 представлено изменение оптичес кой плотности
разных концентраций окисленного цитохрома с в присутствии БХШ 310 при рН
