Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
1D, 6D, 1А и 6А, соответственно (рис. 16). В ходе эксперимента было
установлено, что замещение хромосом пшеницы сорта Безостая 1 на хромосомы
А-генома пшеницы сорта Альбидум 114 не вызывает изменения уровня
экспрессии генов, кодирующих данный белок (при замене хромосомы 6А), или
даже вызывает незначительное снижение уровня его экспрессии (при замене
хромосомы 1А). В то же время введение в геном пшеницы сорта Безостая 1 6-
ой хромосомы из D-генома пшеницы сорта Альбидум 114 вызвало увеличение
уровня содержания интересующего нас белка до 130% к уровню его содержания
у Безостой 1, а введение в геном Безостой 1 Ш-хромосомы пшеницы Альбидум
114 вызвало увеличение содержания белка 310 кДа до 138% к уровню его
содержания у Безостой 1. Ранее было установлено, что уровень содержания
этого белка у пшеницы сорта Альбидум 114 составляет 154% по отношению к
его содержанию у Безостой 1 (табл. 5) (Войников и др., 1998).
Рис. 16 Рокет-иммуноэлектрофореграммы белков проростков озимой пшеницы
сорта Альбидум 114 (1) и белков линий озимой пшеницы сорта Безостая 1 с
замещением пар хромосом от пшеницы сорта Альбидум 114 (2-5).
В гель внесена сыворотка на БХШ 310. Белок окрашен Кумасси R-250.
Белки: пшеница Альбидум 114 (1); линии с замещенными хромосомами 1D (2);
6D (3); 1A (4) и 6A (5).
Следует отметить, что и относительное содержание белка 310 кДа, и уровень
морозостойкости линий пшеницы сорта
39
Безостая 1 с замещенными хромосомами 1D и 6D ниже, чем у пшеницы сорта
Альбидум 114. То же можно сказать и о степени эффекта изменения
активности митохондрий при их переходе в низкоэнергетическое состояние.
Объясняется это по всей видимости тем, что в клетках замещенных линий
хромосомы 1D и 6D пшеницы Альбидум 114 оказались в иной генотипической
среде и экспрессия их генов изменилась.
Таким образом, на основании полученных результатов можно с достаточной
степенью уверенности сделать вывод, что гены, кодирующие белок с
молекулярной массой 310 кДа, локализованы в 1-ой и 6-ой хромосомах D-
генома озимой пшеницы, причем 1D хромосома в большей степени ответственна
за степень экспрессии данного белка в клетке.
6 Влияние БХШ 310 на функционирование митохондрий в условиях гипотермии
Как было установлено ранее, в ответную реакцию на гипотермию вовлекаются
клеточные органеллы, в том числе митохондрии (Войников, 1987). В
частности установлено, что кратковременное охлаждение проростков
морозоустойчивых озимых злаков приводит к термогенезу за счет перехода
митохондрий в низкоэнергетическое состояние, характеризующееся снижением
сопряженности окисления и фосфорилирования и увеличением
нефосфорилирующего дыхания (Войников, 1987). При этом показано, что
переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние находится под
генетическим контролем (Leenders et al., 1974) и предполагается, что при
гипотермии в растительных клетках синтезируются стрессовые белки,
индуцирующие этот переход в митохондриях (Войников, 1987). Для проверки
предположения, не является ли стрессовый белок БХШ 310 посредником,
индуцирующим этот переход, были проведены эксперименты по инкубации
митохондрий in vitro в условиях гипотермии в присутствии в среде
инкубации стрессового белка БХШ 310.
40
В ходе этих экспериментов митохондрии выделяли из срезанных побегов
озимой пшеницы с помощью дифференциального центрифугирования по ранее
описанному методу (Войников и др., 1991) и использовали для двух целей:
для экстракции из них белков и для анализа энергетической активности.
Для очистки органелл митохондриальный осадок, полученный с помощью
дифференциального
центрифугирования, ресуспендировали в среде следующего состава: сахароза
(250 мМ), КН2РО4 (18 мМ), рН 7.4. Очистку проводили с помощью перколла
(21%).
Из очищенных митохондрий экстрагировали белки и растворяли их в 3 мМ
фосфатном буфере, содержащем 0.15 М NaCl и использовали для анализа
методом двойной иммунодиффузии в геле по Ухтерлони (Остерман, 1983). При
реакции антисыворотки на БХШ 310 с митохондриальными белками
(легкорастворимыми белками матрикса) образовывалась четкая линия
преципитации, говорящая о наличии этого антигена в белках митохондрий
(рис. 17).
Рис. 17. Двойная иммунодиффузия в 1% агарозном геле сыворотки против БХШ
310 и белков митохондрий озимой пшеницы.
1 - белки митохондрий, 2-сыворотка против БХШ 310.
Результаты, полученные в эксперименте по двойной иммуно диффузии,
послужили основанием для изучения влияния белка с молекулярной массой 310
кДа на энергетическую активность изолированных митохондрий при
гипотермии. Для этой цели митохондриальный осадок ресуспендировали в
среде следующего состава: MOPS-KOH буфер (20 мМ, рН 7.4), сахароза (0.3
М), КН2РО4 (18 мМ), БСА (0.05%), АТФ (4 мМ), АДФ (4мМ), малат (10 мМ),
глутамат (1
41
мМ). Полученную суспензию митохондрий делили на три части, в первую из
которых добавляли выделенный стрессовый белок (1 мг белка на 3 мг
митохондриального белка), во вторую -такое же количество БСА, в третью
