Регуляция ферментативной активности - Коэн Ф.
Скачать (прямая ссылка):
Показано, что механизм действия токсина заключается в подавлении белкового синтеза; в культуре клеток оно наступает через 1—2 ч [41]. В бесклеточиых системах подавление имеет место только в том случае, если в систему наряду с токсином вводили NAD. Оказалось, что происходит модификация одного из компонентов системы синтеза белка, а именно фактора элонгации 2(ФЭ-2), который необходим для GTP-зависимой транслокации пептидил-тРНК с акцепторно-
го на донорный участок рибосомы, а также для перемещения мРНК на один нуклеотидный триплет после каждого цикла образования пептидной связи. Установлено, что дифтерийный токсин — это фермент, катализирующий ADP-рибозилйрование ФЭ-2; таким образом, было найдено простое объяснение его высокой токсичности:
ФЭ-2 + NAD+ :г+ ADP-рибоза—ФЭ-2 +
ADP-рибозильная группа присоединяется к одному из атомов азота в кольце дифтамида (производное гистидина, рис. 5.9). Это соединение не было обнаружено «и в одном белке, кроме ФЭ-2 [42]. ADP-рибозилиро-вание ФЭ-2 не влияет на его способность взаимодействовать с GTP или связываться с рибосомами, однако •GTP-азная активность при ADP-рибозилировании исчезает. В результате GTP не гидролизуется до GDP и яептидил-тРНК не транслоцируется от акцепторного участка рибосомы на донорный.
Дифтерийный токсин синтезируется в форме, не обладающей ферментативной активностью. Для появления активности необходимо, чтобы молекула токсина была расщеплена в определенных участках протеиназой, а дисульфидные мостики восстановлены. На рис. 5.10 показан механизм активации,’ осуществляемой трипсином. Трипсин «надрезает» молекулу токсина по связям, образованным тремя сближенными в
+ Никотинамид + Н+.
I
сн2 сн3 I I +
C(H)-N—СН, I I
I
nh2
Рис. 5.9. Предполагаемая структура днфтамида (2-[3-карбокса-мидо-3-(триметиламиио) пропил] гистидина) [42].
Интактный токсин Д#г_в1 ООО
реактивный, токсичный
«С
S-S S-S
I I I I
-КС
S-S' S — S
I I I I
RSH 1 -
.Трипсин
"Надрезанный токсин" Л/г61000
неактивный, токсичный
SH
I Фрагмент А N| |С Mr 21000
SH SH SH
,1 I I
активный, нетоксичные
Фрагмент В
Мт 40 ООО
неактивный, нетоксичный^
Рис. 5.10. Механизм активации дифтерийного токсина трипсином.
структуре остатками аргинина (189, 191 и 192 с N-koh-ца). В результате восстановления ряда дисульфидных, мостиков образуется ферментативно активный N-koh-цевой A-фрагмент и неактивный С-концевой В-фраг-мент. Однако в отличив от интактного и «надрезанного» токсина ни фрагмент А ни фрагмент В не оказывают токсического действия на культуру клеток.
Были выделены мутантные белки, не обладающие токсичностью из-за изменений либо в А-, либо в В-час-ти молекулы. Смесь нетоксичного мутантного белка, измененного в A-части молекулы, и нетоксичного мутантного белка, измененного в В-части, приобретала токсичность лишь в том случае, если ее сначала инкубировали с трипсином, затем с тиолом, а потом удаляли тиол диализом (в условиях, обеспечивающих окисление SH-групп с образованием дисульфидных мостиков). Эти эксперименты по «гибридизации» отчетливо показали, что для токсичности молекулы необходимы как В-часть, так и A-часть, обладающая ADP-рибозилирующей активностью. В опытах на культуре клеток нетоксичные белковые мутанты с неактивным A-фрагментом вели себя как конкурентные ингибиторы нативного токсина. Отсюда следует, что токсин связывается со специфическими рецепторными участками на поверхности клетки. Впоследствии было установлено, что связывание интактного или «надрезанного» токсина с клетками осуществляется в результате взаимодействия его молекул с молекулами гликопротеина, расположенными на поверхности клетки [43]. Следует отметить, что сначала в клетку проникает А-субъединица; механизм это-
го процесса остается еще невыясненным. In vivo ¦«надрезание» токсина может осуществляться протеи-назами, присутствующими в крови (гл. 3) или внутри клетки. Внутриклеточное восстановление дисульфид* ных связей происходит, по-видимому, при участии глутатиона или тиоредоксина; образующийся А-фраг-мент катализирует инактивацию ФЭ-2. Синтез белка в различных внутренних органах оказывается подавленным, и это обусловливает их патологические изменения. Таким образом, события сводятся к ковалентной модификации двух типов — ограниченному лротеолизу и ADP-рибозилированию.
Токсин, вырабатываемый бактериями другого вида (P. aeruginosa), катализирует такую же реакцию, как дифтерийный токсин [44]. Наблюдаемые при его действии симптомы (гипотензивный шок у собак и обезьян) отличаются от тех, которые характерны для дифтерии, что обусловлено различиями в клеточной специфичности данных токсинов. Важной характеристикой токсина P. aeruginosa является его стабильность in vivo.
5.4.2. Механизмы действия холерного токсина, токсина коклюша и токсина сибирской язвы
