Регуляция ферментативной активности - Коэн Ф.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 5.4. Зависимость между степенью аденилироваиия и удельной активностью глу-таминсиит&газы. (О—О) — Ме2+-зависимая активность, ф—ф Мп2+-зависимая активность; X---------X Mg2+-
зависимая активность, наблюдаемая при смешивании Ео н 'Е|! в различных соотношениях.
30
20
ю
Число возможных форм глутаминсинтетазы (если учесть не только число аденилированных групп в молекуле фермента, но также их взаимное расположение в двух гексагональных кольцах)- составляет 382! Приведенные на рис. 5.4 данные показывают, что гибридные молекулы с различными свойствами действительно существуют. Видно, что удельная активность глутаминсинтетазы не является линейной функцией степени аденилироваиия; наиболее резко выражены различия активности у форм, приближающихся‘по структуре к Ео и Е[2. Частично аденилированные формы отличаются также от эквивалентной смеси форм Е0 и Ei2 по другим кинетическим параметрам и по устойчивости к денатурации [12, 13].
Активность отдельной субъединицы в составе олигомера зависит от состояния соседних субъединиц (аденилйрованы они или не аденилированы), вероятно, из-за аллостерического влияния, которое передается через межсубъединичные контакты. Аналогичное предположение было высказано для АТКазы (гл. 2). Возможно, первоначально исследованные препараты глутаминсинтетазы представляли собой частично аденилированные формы фермента [2], поскольку для них было обнаружено кумулятивное ингибирование по типу обратной связи всеми восемью конечными продуктами и, кроме Того, они оказались более чувствительными к этим ингибиторам, чем Ео и EJ2.
5.1.3. Регуляция аденилирования и деаденилирования путем обратимого уридилирования
При переносе Е. coli из среды, богатой NH^, в бедную этим соединением среду происходит быстрая реактивация глутаминсинтетазы, что указывает на обратимость процесса аденилирования [6]. Данное наблюдение привлекло внимание к проблеме регуляции1 деаденилирования и послужило началом серии интересных исследований, результаты которых приведены' ниже.
1. При деаденилировании происходит фосфорили-тическое .расщепление связи тирозил-О-АМР [14]:
Е12 (АМР) + 12Pj------>- Е0,+ 12ADP. (5.2>
2. В реакции деаденилирования участвуют два белка, обозначенные Pi и Рц [15].
3. Белок Pi идентичен АТазе. Следовательно, один и тот же фермент катализирует оба процесса: адени-лированиеи деаденилирование [16].
4. АТаза (Мг=130000) представляет собой бифункциональный полипептид с автономными каталитическими участками для реакций аденилирования и деаденилирования [17].
5. Белок Рн существует в двух формах, названных. Рп—А и Рп—D. В реакции аденилирования субстратами служат глутаминсинтетаза и АТР, а активаторами —I Рп—А и глутамин. Рп—А активирует реакцию, увеличивая сродство глутаминсинтетазы (в 16 раз) » глутамина (в 10 раз) к АТазе. Рц—А не влияет на Vma* АТазы. Глутамин же увеличивает как Vmax (в 20 раз)* так и сродство к АТазе субстратов — глутаминсинтетазы (в 6 раз) и Рп—А (в 10 раз) [3]. Для реакции деаденилирования абсолютно необходимы Рп—D, а также АТР и а-кетоглутарат [18].
6. Для превращения Рп—А в Рп—D необходимы-UTP, специфичный фермент, а также АТР или а-кетоглутарат. В присутствии обоих активаторов — АТР и а-кетоглутарата — реакция образования Рц—D ускоряется еще в 2—3 раза. Глутамин и Pi эту реакцик> ингибируют [19, 20].
7. Белок Рп (Мг=44 ООО) состоит из четырех идентичных субъединиц. Превращение Рп—А в
Рп—D происходит в результате катализируемого специфичной уридилилтрансферазой (иТазой) ковалентного присоединения UMP (уридилирования) к одному или двум тирозильным остаткам каждой субъединицы [21]:
U Таза, Mg»+
Рц—А + 4UTP--------> Р„—D(UMP) + 4РРь (5.3)
8. Деуридилирование катализируется уридилил-¦отщепляющим ферментом (UR-ферментом). Этот фермент может функционировать в присутствии либо Мп2+, либо Mg2+, но в последнем случае необходим еще а-кетоглутарат или АТР. В присутствии обоих активаторов —¦ АТР и а-кетоглутарата — активность _Mg2+-3aBHCHMOfi формы UR-фермента увеличивается еще в 2 раза №
UR-фермент, Ме*+
Рц—D (UMP) + 4Н20--------------->- Рц—А + 4UMP. (5.4)
иТаза и UR-фермент образованы одним полип’еп-тидом (Мг=98 ООО), который, подобно АТазе, проявляет бифункциональные свойства [23].
Суммируя приведенные данные, следует сделать заключение, что активность глутаминсинтетазы регулируется двумя каскадными системами, действие которых приводит к противоположным эффектам (рис. 5.5).
Инактивация глутаминсинтетазы (аденилирова-ние) инициируется UR-ферментом, катализирующим превращение Рп—D в Рп—А (деуридилирование). В результате взаимодействия Рц—А с АТазой последняя приобретает способность катализировать аденили-рование глутаминсинтетазы. Сходным путем осуществляется и активация глутаминсинтетазы (деаденили-рование); этот процесс инициируется иТазой и заключается в превращении Рц—А в Рц—D (уридилирова-ние). В комплексе с Рц—D АТаза катализирует деаде-нилирование. Таким образом, в данной ситуации направление и скорость ферментативной реакции определяют аллостерические переходы, индуцируемые связыванием белка Рц.
