Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Стабилизирующий эффект тиаминпирофосфата можно объяснить с точки зрения конформационной лабильности белковой молекулы (подробнее об этом см. стр. 96). Но это не единственная возможность. Для тиаминовых ферментов причина может заключаться также и в сохранении их четвертичной структуры. Как уже отмечалось выше, мономерная форма тиаминовых ферментов значительно более лабильна, чем димерная. В то же время кофермент способствует ассоциации мономеров в димер. Поэтому другая причина стабилизации тиаминовых ферментов тиаминпирофосфатом может заключаться в том, что в его присутствии увеличивается доля фермента, находящегося в более стабильной, димерной форме.
О содержании упорядоченных структур в молекуле тиаминовых ферментов сведения ограничены. Содержание а-спиральной конформации в декарбоксилазном компоненте пируватдегидрогеназного комплекса сердечной мышцы свиньи, транскетолазе пекарских дрожжей и пи-руватдекарбоксилазе пивных дрожжей составляет соответственно 17% [294], 20% [283] и 25% [518]. Величины, как видим, достаточно близкие. Однако по причинам, о которых уже говорилось выше (стр. 59), к оценке абсолютных значений, характеризующих содержание отдельных упорядоченных структур в молекуле белка, нужно подходить осторожно.
Интересно заметить, что в транскетолазе найдено
212
относительно высокое содержание fi структур [283], в ТС время как в пируватдекарбоксилазе они не обнаружены совсем [518]. И еще одно существенное различие двух этих ферментов. В транскетолазе, если судить по аминокислотному составу и определению сульфгидрильных групп в молекуле фермента, имеется шесть дисульфид-пых связей [25]. Их наличие подтверждают и другие экспериментальные данные. В то же время в пируват-декарбоксилазе дисульфидные связи отсутствуют [518].
Активный центр пируватдекарбоксилазы носит гидрофобный характер. Это показано с использованием тио-хромпирофосфата — неактивного аналога тиаминпирофосфата, способного конкурировать с коферментом за активный центр пируватдекарбоксилазы. Данный аналог обладает собственной фтуоресценцией. При его взаимодействии с апоферментом происходили характерные изменения в спектре флуоресценции. Они были аналогичны тем изменениям, которые наблюдались в модельной системе, когда тиохромпирофосфат помещали в среду с низкой диэлектрической постоянной (см. главу VII).
Гидрофобная природа активного центра пируватдекарбоксилазы была подтверждена и в опытах с 2-п-то-луидинонафталин-6-сульфоновой кислотой, которая связывается в основном только с гидрофобными участками белковой молекулы, что сопровождается значительным увеличением интенсивности флуоресценции данного индикатора (см. главу VIII).
Ничего подобного не было получено с транскетола-зой, когда были использованы указанные подходы для исследования ее активного центра. Тиохромпирофосфат хотя и конкурировал с тиаминпирофосфатом за активный центр фермента, но тем «е менее при взаимодействии аналога с апотранскетолазой никаких изменений в спектре флуоресценции не обнаружено. Не менялась и флуоресценция 2-гс-толуидинонафталин-6-сульфоновой кислоты (а также 1-анилино-8 нафталинсульфоната — другого флуоресцентного индикатора) при ее добавлении к апотранскетолазе [216].
Таким образом, природа активных центров пируват-декарбоксилазы и траискетолазы существенно различается. Это находит свое выражение и в поведении аналогов тиаминпирофосфата при их взаимодействии с двумя указанными ферментами. В соответствии с гидрофобной
213
природой активного центра пируватдекарбоксилазы определенный вклад во взаимодействие кофермента с апо-ферментом вносит 2'-метильная группа тиаминпирофосфата. Замена метильной группы на этильную дает аналог, константа сродства которого к апоннруватдекар-боксилазе даже несколько выше, чем для нативного кофермента [555]. Для транскетолазы величина константы сродства того же самого аналога к апоферменту в пять с лишним раз меньше по сравнению с величиной для тиаминпирофосфата [216].
Окситиамиигшрофосфат, неактивный аналог кофер-мента, у которого аминогруппа заменена на гидроксильную, взаимодействует с апопируватдскарбоксилазон так же, как и тиаминпирофосфат [555]. Более того, он достаточно легко вытесняется коферментом из его связи с белком, и полное замещение аналога на тиаминпирофос-фат осуществляется намного быстрее, чем взаимодействие кофермента со свободной, не связанной с оксити-аминпирофосфатом, апопируватдекарбоксилазой [433]. В то же время сродство окситиаминпирофосфата к апо-транскетолазе значительно выше, чем тиаминпирофосфата [216], и его вытеснение из связи с белком осуществляется крайне медленно и происходит далеко не полностью даже при использовании высокой концентрации кофермента [134].
И, наконец, при взаимодействии тиаминпирофосфата с апотранскетолазой образуется комплекс с переносом заряда, что находит отражение в соответствующих изменениях спектра поглощения и циркулярного дихроизма [281, 282]. Этого не наблюдалось 'при исследовании взаимодействия кофермента с апопируватдекарбоксилазой [518].
