Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Пируватдекарбокснлаза из Zymomonas mobilis и аце-толактатсинтстаза из Aerobacter aerogenes теряет часть кофермента при однократном пропускании их через сефадекс. Оставшееся его количество прочно связано с белком и не отделяется от него даже при повторных пропусканиях через сефадекс [361].
В нативной холотранскстолазе определено содержание кальция в количестве 2 г-атом на моль фермента [285]. Других двухвалентных катионов практически не обнаруживали. В нативной холопируватдекарбоксилазе, выделенной из пивных дрожжей, найден только магний [179, 180]. Этот же металл, по-видимому, присутствует и в пнруватоксидазе, изотпрованпой из Proteus vulgaris [493]. О количественном содержании магния ничего не известно, так как в обоих случаях ферментные препараты не были гомогенны.
Приведенными примерами ограничиваются данные о качественном и количественном содержании металлов в тиаминовых ферментах, хотя и показано, что практически все эти ферменты в той или иной степени активируются двухвалентными катионами. Исследования в основном проводили в плане сравнения различных ионов металлов, по их способности повышать величину ферментативной активности. Обычно для этих целей использовали ферменты, лишенные кофакторов, и в систему добавляли тиаминпирофосфат и соответствующие катионы. Общепринятым считается, что металл в тиаминовых ферментах выполняет функцию «мостика» между белком и тиаминпирофосфатом, принимая, таким образом, участие в образовании холофермента.
207
С транскетолазой пекарских дрожжей установлено, что для образования холофермеита из апофермента и тиаминпирофосфата наличие двухвалентных катионов обязательно [32]. Нельзя, однако, исключить возможности взаимодействия тиаминпирофосфата с активными центрами других ферментов и без участия двухвалентных катионов. Специальные исследования в этом плане в металлостерильных условиях с использованием апофермента, полностью лишенного ионов металла, не проводили, но некоторые косвенные данные указывают на такую возможность [250, 361, 377, 392, 478].
Активирующее действие катионов с разными ферментами выражено в неодинаковой степени. Так, для транс-кетолазы пекарских дрожжей активирующая способность ионов металлов возрастала в следующем ряду: марганец>магнии>железо, цинк, никель:> кобальт, кальций>кадмий (29), а для пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей этот ряд выглядел таким образом: маг-ний>-марганец>кобальт>кадмий>>цинк >> кальций> >железо (180). В то время как ацетоинсинтетаза из Streptococcus feacalis активировалась только магнием, марганцем или кобальтом, другие двухвалентные катионы влияния на каталитические свойства фермента не оказывали [146].
Транскетолаза, выделенная как из пивных, так и из пекарских дрожжей, активируется кальцием, марганцем, магнием и кадмием, хотя по степени активации указанными катионами эти ферменты различаются. Но более существенно в данном случае то, что каталитическая активность первого фермента не изменяется при добавлении в среду ионов цинка [377], а активность второго существенно 'повышается [29]. Концентрация добавленного металла в обоих случаях была одинакова.
Многие ионы двухвалентных металлов повышают скорость реконструкции холофермеита из апофермента и кофермента. Оказалось, что для пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей эффект в присутствии кальция был максимальный [432], а с тем же ферментом, но выделенным из пекарских дрожжей,— минимальный [429].
Существенное влияние оказывает природа катиона на прочность связи тиаминпирофосфата с белком. И в этом смысле различные ферменты ведут себя неодинаково. От холотранскетолазы, реконструированной *в присут-
208
ствии кальция, кофермент не отделяется при гель-фильтрации. Это было показано с транскетолазой, выделенной из пекарских дрожжей [32] и пивных дрожжей [377]. Если при реконструкции -вместо кальция в среду был добавлен магний, то при последующем пропускании через сефадекс наблюдалось частичное отщепление тиаминпирофосфата от холофермента, в несколько большей степени выраженное в том случае, когда в опытах использовали транскетолазу пивных дрожжей.
Противоположная картина наблюдалась с пируват-декарбоксилазой пивных дрожжей [443, 445]. Холофермент, реконструированный в присутствии магния, при пропускании через сефадекс сохраняет свою активность, и для ее проявления не требуется добавлять кофакторы извне. Другими словами, тиамиипирофосфат в этих условиях связывается с белком необратимо. Если же реконструкцию проводили в 'присутствии кальция, то при гельфильтрации кофермент полностью отщеплялся и переходил в раствор, т. е. связывание тиаминпирофосфата с белком было обратимое.
Данных о влиянии различных катионов на каталитические свойства тиаминовых ферментов в литературе приводится очень много, но не всегда возможно их сопоставить и с уверенностью говорить о природе этого влияния. Причиной является неидентичность условий проведения экспериментов. В то же время компоненты реакционной среды существенно влияют на свойства тиаминовых ферментов, в том числе и на их способность взаимодействовать с тиаминпирофосфатом. Например, в случае транскетолазы природа буфера и наличие в среде субстрата резко изменяют величину Кт для кофермента, и их действие не проявляется, если исследования проводили в присутствии кальция [21].
