Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Была сделана попытка отделить их на ионообменных колонках. Вначале работу проводили в диапазоне pH 7 -9, где транскетолаза наиболее стабильна. При pH 7,0 на хроматографическом профиле были видны перекрывающиеся инки транскетолазы и глицеральдегидфосфат-дегндрогеназы. Второй ник, резко асимметричный, представлял собой смесь двух форм глицеральдегидфосфат-дегндрогеиазы. Их четкое разделение происходило при использовании ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного 2-• 10~2 М трис-буфером, pH 9, и градиентной элюции трис-буфером, исходная величина pH которого равнялась 7. При этом одна из форм глицеральдегидфосфатдегидро-геиазы практически полностью отделялась от транскетолазы, в то время как хроматографический профиль другой формы практически полностью совпадал с хромато графическим'профилем транскетолазы [30].
Это максимальный результат, которого удалось достичь, работая в диапазоне pH 7-9, используя различ-
1/.,7 Г. А. Кочетов
193
иые нонообмениики и широко варьируя условиями хроматографирования. При pH 9 удалось, по крайней мере, четко отделить одну из форм глицеральдегидфосфатде-I идрогеназы. В других случаях не происходило и этого.
Хроматографирование ферментных препаратов при низких значениях pH дало следующие результаты. На рис 50, а приведены экспериментальные данные, получен-
Е/мл
0,1 \ 4
194
Рис. 50. Хроматографирование препарата т ранено гола.ш на КМ-се-фадсксе [30]
Колонка уравновешена 4.5-10-* М калий-фосфашым буфером; а — pH 5,г»; <> — pH G.0; в — pH 6,5; г — 6.Г>5; / — концентрация элюирующего буфер:!, 2 — транскетолазная активность; 3 — глицеральдегидфосфатдегидрогеназная ал-швность. По оси ординат— величина ферментативной активности
ные при использовании КМ-сефадекса, уравновешенного 5-10-2 М калий-фосфатным буфером, pH 5,5. Видно поч-ное разделение изоформ транскетолазы. Неполностью, но достаточно хорошо разделяются и формы глицеральде-гндфоефатдегидрогеназы, причем одна из них элюируется с колонки вместе с изоформой I транскетолазы.
Интересные данные были получены при незначительных изменениях pH калий фосфатного буфера, которым уравновешивалась колонка. Повышение pH всего на половину единицы (pH 6 на рнс. 50, б по сравнению с pH 5,5 на рис. 50, а) 'приводило к тому, что формы глнцераль-дегидфосфатдегндрогсназы переставали разделяться и обе теперь элюировались с колонки вместе с пзоформоп
I транскетолазы (см. рнс. 50,6). Другими словами, положение свободной формы глицсральдегидфпсфатдсгнд-рогеназы на хроматографическом профиле при повышении pH сметалось влево. В том же направлении, но в разной степени происходило смещение и всех других белковых фракций (сравни рис. 50, б и а).
Отмеченная тенденция продолжала выявляться н при дальнейшем повышении pH буфера, которым уравновешивалась колонка. Теперь (при pH 6,5) свободная форма глицеральдегидфосфатдегидрогеназы вообще не связывалась ионообменниками и снималась с колонки уже
195
7*
при посадке (рис. 50, в), а пики траискетолазной активности сливались в одни. И наконец при pH 6,65 изоформа II траискетолазы элюировалась раньше, чем изоформа I (рис. 50, г), в противоположность тому, что наблюдалось при pH 5,5 (см. рис. 50, а).
При сопоставлении данных, представленных на рис. 50, а, б, в, г, отчетливо видно, что изменение pH буфера, которым уравновешивается колонка, резко сказывается иа хроматографическом поведении отдельных белковых фракций ферментного препарата. Происходит столь значительное перемещение их вдоль всего хроматографического профиля, что качественно меняется вся наблюдаемая картина. Например, в одних условиях раньше снимается нзоформа I траискетолазы, а в других— нзоформа II. То же самое относится и к двум формам глицеральдсгидфосфчтдегидрогеназы. Несмотря иа это, всегда обнаруживалась белковая фракция, содержащая как транскетолазу, так и глицеральдегидфосфат-дегндрогеиазу, причем пики активностей ферментов на хроматографическом профиле всегда совпадали.
Приведенные экспериментальные данные убедитепь-ио подтверждают выдвинутое выше предположение о том, что в недостаточно очищенных црепаратах трапске-толазы содержится комплекс двух связанных между собой ферментов — траискетолазы и глицеральдсгидфос-фатдегидрогеназы. В пользу этого же говорят следующие экспериментальные данные [280].
Если ферментный препарат, который при хроматографировании на КМ-сефадсксс в кислой среде даст обычную хроматографическую картину, т. е. наличие трех ников, соответствующих изоформс II транскетола-зы, свободной форме глицеральдегидфосфатдегидроге-назы и содержащий обе активности (рис. 51, а), предварительно подвергнуть дробному фракционированию сульфатом аммония и только затем нанести на колонку, то свободная форма глицеральдегидфосфатдегидрогена-зы в элюате не обнаруживается (рис. 51,6). При фракционировании сульфатом аммония эта форма осталась в маточном растворе. Если препарат фермента, полученный в опыте, представленном на рис. 51,6, и не содержащий свободной формы глицеральдегидфосфттдегидроге-иазы, выдержать в растворе сульфата аммония 40 — 50%-ного насыщения в течение определенного времени,
