Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 68

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 86 >> Следующая

190
геназы п получить однородные препараты транскетолазы [30, 280].
Наличие глицеральдегидфосфатдегидрогеназы в препаратах транскетолазы казалось неожиданным, так как, судя по литературным данным о свойствах глицеральде-гидфосфатдегндрогеназы [273, 317, 526], этот фермент должен был легко отделяться от транскетолазы в процессе хроматографирования на ДЭАЭ целлюлозе н последующего обычного фракционирования сульфатом аммония — стадии очистки, предусматриваемые методикой Рекера и сотр. Вопрос этот был важен не только с чисто практической точки зрения — для получения вы-сокоочищенных, однородных препаратов транскетолазы, по мог представлять и общий теоретический интерес. Поэтому мы и занялись изучением его [30, 280].
На предпоследней стадии очистки транскетолазы по методу Рекера и сотр. препарат фермента пропускается через колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 5 -10 3 Л! кальций-фосфатным буфером, pH 7,7. Эноция осуществляется тем же буферным раствором. Именно на этой стадии уже предполагалось получить разделение транскетолазы и глицеральдегидфосфатде-гидрогеназы. Как, однако, показал детальный анализ фракций элюата, оба фермента снимаются вместе. При этом транскетолаза элюируется с колонки в виде одного пика активности, а глицеральдегидфосфатдегндрогена-за — в виде трех, каждый из которых соответствует, невидимому, индивидуальной форме фермента.
Анализ белковых фракций, снимаемых с колонки при последующей элюции повышающимися концентрациями хлористого калия, не прояснил картины. Единственно, что удалось обнаружить — это еще одну форму глице-ральдегидфосфатдегидрогеназы. Данная форма фермента при хроматографировании на КМ-сефадексе при pH 6,0 не связывалась ионнообменником и сходила с колонки уже при посадке ферментного препарата, в то время как три другие формы, а также транскетолаза снимались лишь aipn градиентной элюции. Качественное разделение активностей двух ферментов было такое же, как и в первом случае, когда использовали ДЭАЭ-цел-люлозу. И опять наблюдали совпадение одного из пиков активности глицеральдегидфосфатдегидрогеназы с пиком активности транскетолаза.
J91
Рис. 49. Электрофорез препарата транскетолазы в полиакриламидном геле [280]
Гистохимическое выявление ферментативной активности: а — в системе для
выявления транскетолазы; б —в той же системе, но без добавления вспомогательного фермента — глицеральдегнд-фосфатдегидрогеназы; в—в системе для выявления глицеральдегидфосфат-дегидрогеназы
+ а б ff
Препарат фермента после очистки его на ДЭАЭ-цел-люлозе быч подвергнут электрофоретическому разделению в полиакриламидном геле. Затем гель прокрашивали па белок и гистохимически выявляли наличие активностей обоих ферментов в белковых зонах [280].
Индивидуальные активности транскетолазы и глице-ральдегидфосфатдегидрогеназы, естественно, выявлялись в соответствующих системах, обычно используемых для гистохимического определения указанных ферментов (рис. 49,а,в). Оказалось при этом, что одна из белковых фракций интенсивно прокрашивалась и в том случае, если использовали систему для выявления транскетолазы, из которой был исключен один из компонентов — мышечная глицеральдегидфосфатдегидрогеназа.
Приведенные экспериментальные данные являются веским основанием для того, чтобы считать зону I белковой фракцией, представляющей собой комплекс двух функционально связанных ферментов.
Фосфоглицсриновый альдегид — продукт транскето-лазпой реакции, образующийся под действием одного из ферментов комплекса,— не высвобождаясь в среду, немедленно претерпевает дальнейшие превращения, катализируемые другим ферментом, входящим в состав комплекса. Результатом непрерывной последовательности реакций, катализируемой комплексом двух функционально связанных между собой ферментов, является гистохимическое прокрашивание белковой фракции в опыте, изображенном на рис. 49, б.
С приведенными рассуждениями хорошо согласуется тот факт, что хотя в зонах II и III оба фермента очень
II
III
0U
192
близко расположены и их разделение лишь намечается, тем не менее эти зоны, в противоположность зоне I, не прокрашиваются в системе для выявления транскетолазы, из которой исключена мышечная глпцеральдсгидфос-фатдегидрогепаза. Очевидно, в данном случае фосфоглн-цериновый альдегид, образующийся иод действием транскетолазы, успевает выделиться в окружающую среду, прежде чем подвергнется действию глицеральдегнд-фосфатдегидрогеназы, несмотря на то, что на электрофо-peipaMMe оба фермента почти соприкасаются.
Дальнейшее исследование причин нахождения глнце-ральдегидфосфатдегидрогеиазы в кристаллических препаратах транскетолазы, получаемых согласно методике Рексра и сотр., было продолжено опять с использованием метода ионообменной хроматографии. Как уже указывалось выше, в процессе очистки на ДЭАЭ-целлюлозе вместе с транскетолазой элюировалась и глицеральде-гидфосфатдегидрогеназа, которая на хроматографическом профиле выявлялась в виде трех форм. Две из них совпадали с пиком активности транскетолазы. Третья форма снималась с колонки последней и лишь частично перекрывала пик активности транскетолазы. Она могла быть удалена -последующим фракционированием сульфатом аммония (см. методику Рексра и сотр. [484]). Две фугне формы выпадали в осадок вместе с транскетолазой.
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed