Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
187
Табли {а 19
Влияние АМФ на активность оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, измеряемую в присутствии различных катионов [538]
Добавлен металл (Ы0-*М) Величина ферментативной активности,
мкмоли НАД, восстановившегося за 1 мин.
в отсутствие в присутствии АМФ
ЛМФ (3.10-« М)
Без добавок 2,17 6 41
Магнии хлористый 5,82 16,51
Кальций хлористый 9,71 15,13
Стронций хлористый 3,77 14,03
Добавление ЛМФ во всех случаях сопровождалось повышением величины определяемой активности (табл. 19).
При этом существенная разница в активности, наблюдаемая в пробах с различными катионами, полностью нивелировалась.
ЛЦЕТОЛ АКТ ATCIШТЕТАЗА
Ацетолактатспптетаза, обнаруженная в ряде микроорганизмов [86, 197, 400, 489, 520, 521] и в растениях [356], катализирует простое декарбоксилирование пировиноградной кислоты и последующий перенос «активного ацетальдегида» на вторую молекулу пирувата или на а-кетомасляную кислоту. В первом случае образуется а-ацетомолочная кислота, а во втором — а-ацетооксима-сляная. Эти кислоты через ряд последовательных стадий превращаются соответственно в валин и изолейцин.
Таким образом, реакции, катализируемые ацетолак-татсинтетазон, являются первыми в цепи последовательных реакций, приводящих к синтезу валина или изолейцина. Фермент ингибируется этими же аминокислотами, причем действие валина выражено сильнее. Ингибирование неконкурентно по отношению к пирувату.
Все эти данные получены на интактных мито ондриях. После выделения и частичной очистки ацетолактатеннте-тазы его чувствительность к валину и изолейцину уменьшается во много раз, а сродство к коферменту (тиамнн-пирофосфату) повышается [170].
Высокоочищенные кристаллические препараты аце-толактатсинтетазы из Aerobacter aerogenes [486] в аце-
188
CSJ
ffyZ ffj ff,Z 0,4 o,z
r/m
Рис. 48. Влияние ацетата и фосфата на активность ацетолактатсин-1стазы при различных значениях pH [187]
о pH 5,4; б — pH 5,8; о — pH 6,2; Буфер: / — ацетатный; 2 — ацетатный +
фосфатный; 3 — фосфатный
татиом буфере показывают максимальную активность при pH 5,8, а в фосфатном — при pH 5,4 [487]. Во втором случае (как и во всех других исследованных буферах) зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имеет сигмоидальный характер (рис. 48). В ацетатном буфере — она гиперболическая. Добавление фосфата в пробы с ацетатом не только изменяет характер кинетической кривой, но и уменьшает скорость ферментативной реакции, что особенно отчетливо видно в эксперимент; поставленных при pH 5,8 и выше (см. рис. 48, б, в). В присутствии сульфата, который действует аналогично фосфату, коэффициент Хилла был значительно больше единицы, что указывает на наличие в энзиме как минимум двух субстрат-связываюших участков.
Активирующее действие ацетата достаточно специфично. Еще лишь монохлорацетат активировал фермент, то время как лактат, нитрат, сукцинат, малсат, лцета-
189
мид и ацетилфосфат такой способностью не обладали.
Концентрация ацетата в клетках A. aerogenes достаточно высока [75] и сопоставима с той, которая активирует ацетолактатсинтетазу [487]. Нельзя поэтому исключить возможность регуляции активности данного фермента ацетатом в физиологических условиях.
В трис-буфере при pH 6 в ацетолактатсинтетазе титруются примерно с одинаковой скоростью три сульфгидрильные группы. Активность фермента при этом снижается, но его кинетическая характеристика, получаемая в разных буферах, не изменяется. В .присутствии доде-цилсульфата натрия в молекуле ацетолактатсинтетазы открывается еще одна SH-группа. То же самое наблюдается, если вместо додецилсульфата в титруемую пробу добавить ацетат [506]. Действие ацетата специфично, так как ни ацетамид, ни пропионат совершенно не влияют на котичество титруемых групп в ферменте.
Таким образом, три сульфгидрильные группы находятся на поверхности белковой молекулы ацетолактатсинтетазы и могут быть легко оттитрованы, а четвертая— замаскирована, и для ее обнаружения необходима конформационная перестройка белковой молекулы. В настоящее время трудно сказать, имеется ли какая-либо связь 'между изменением конформации, повышением реакционности сульфгидрильной группы и изменением кинетической характеристики фермента в 'присутствии ацетата.
ТРАНСКЕТОЛАЗА
Для выделения и очистки транскетолазы из дрожжей обычно используют методику Рекера и сотр., предложенную еще в 1955 г. [193] и затем модифицированну ю ими же в 1958 г. [484]. Оказалось, однако, что получаемые при этом кристаллические препараты фермента не были однородны и содержали значительное количество глицеральдегидфосфатдегидрогеназы [30, 280, 424, 504]. Количество ее варьировало от препарата к препарату и существенно зависело от условий выращивания дрожжей. Введя в оригинальную методику дополнительную стадию дробного многократно повторяемого фракционирования щелочным раствором сульфата аммония, удалось полностью избавиться от глицеральдегидфосфатдегидро-
