Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
174
температуры от 0 до 37° скорость фосфорилирования увеличивалась и температурный коэффициент составлял величину порядка двух. Это указывает на то. что фосфо-рилирование является ферментативным процессом, а не происходит в результате простой адсорбции радиоактивного фосфора на белке.
Высокоочищенная фосфатаза, в противоположность грубым препаратам фермента, не активировалась циклической АМФ (474]. Не исключено, что при очистке фермента предполагаемая киназа фосфатазы уходит с балластными белками и что это явилось причиной отрицательных результатов. Не было, однако, выявлено влияния аденозинциклофосфата и при исследовании фосфатазы, выделенной из других источников (почки и сердце быка), даже при использовании неочищенных препаратов фермента [259]. Правда, в качестве исходного материала здесь использовали митохондрии, а не тканевой экстракт, как в первом случае.
Трудно на основании имеющихся в настоящее время литературных данных делать какие-либо определенные выводы. Тем не менее ясно, что вопрос этот важен с точки зрения механизма регуляции тиамнновых ферментов и требует дальнейшего изучения.
В заключение данного раздела отметим следующее. Как указывалось выше, активность киназы и фосфатазы существенно зависит от концентрации ионов магния в среде, причем если фосфокиназная активность еще проявляется в слабой степени в отсутствие катиона, то фосфатаза полностью неактивна. Сродство магния к киназе значительно выше, чем к фосфатазе. Это может иметь физиологическое значение в системе регуляции фосфатазы. Дело в том, что общее содержание магния, например, в митохондриях печени крыс, составляет 20— 25 нмолей на 1 мг белка [95], и около половины всего количества приходится на матрикс. Судя по литературным данным [100, 450, 481], пнруватдегидрогеназный комплекс с его регуляторными ферментами — киназой и фосфатазой—также локализован в митохондриальном матриксе. Концентрация свободного магния в матриксе может зависеть от соотношения АТФ/АДФ, так как, во-первых, содержание адениновых нуклеотидов в митохондриях равно 10 -15 нмолей на 1 мг белка [147], т. е. примерно такое же, как и содержание магния в матриксе,
175
а во-вторых, сродство магния к АТФ значительно выше, чем к АДФ (113]. Таким образом, уменьшение отношения АТФ/АДФ должно сопровождаться увеличением концентрации свободного магния, что в свою очередь приводило бы к активации фосфатазы пируватдегндрогеназы.
Количественное содержание отдельных ферментов в пируватдегидрогеназных комплексах
Мы уже говорили, что пируватдегидрогеназные комплексы состоят из трех ферментов, катализирующих ряд последовательных стадий окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты. Липоилтрансацетилаза, кроме каталитической, выполняет еще и структурную функцию, осуществляя связывание двух других ферментов (эти два фермента друг с другом стабильного комплекса не образуют). Согласно данным электронной микроскопии [262], молекула липоилтрансацетилазы должна состоять из 60 идентичных или очень близких по свойствам полипептидных цепей и включать в себя 60 эквивалентных участков связывания пируватдекарбоксилазы и столько же — для липоилдегидрогеназы. Для проверки такого заключения в лаборатории Рида был разработан метод получения высокоочищенных препаратов пируватдегидрогеназных комплексов из митохондрий почек и сердца быка и последующего их разделения на составляющие компоненты без потери ими своих нативных свойств [327—329]. Выделенные комплексы и индивидуальные ферменты были тщательно проанализированы, и при этом получены следующие результаты [84, 259, 327].
Препараты липоилтрансацетилазы, изолированные из пируватдегидрогеназных комплексов почек и сердца быка, оказались очень близки по мол. весу (3 120 ООО± ±200 000), аминокислотному составу и характеру пептидных карт триптических гидролизатов. Методом седимен-тационного равновесия в 6 М гуанидинхлориде показано, что каждый из указанных ферментов состоит из 60, по-видимому, идентичных полипептидных цепей (мол. вес 52 000), содержащих по одному остатку ковалентно связанной липоевой кислоты.
Ппруватдекарбоксилазные компоненты ннр\ватдегнд-рогепа.шых комплексов также очень близки по свойствам. Каждый представляет собой тетрамер, имеющий
176
структуру аа, Р(3 и мол. вес порядка 154 000. В молекуле пнруватдегндрогеназных комплексов содержится 30 молекул пируватдекарбоксилазпого компонента, т. е. на 60 полипептидных цепей липоплтрансацетплазы приходится 60 пируватдскарбоксилазных единиц типа ар. Остается неясным, в какой форме пируватдекарбоксилаза находится в пнруватдегидрогеназном комплексе — в тет-рамерной (а2р2) или в виде димерных функциональных единиц (оф), которые лишь в процессе выделения н очистки фермента объединяются в тетрамер.
Неожиданно низким оказалось содержание в пируват-дегидрогеназном комплексе третьего фермента — липоил-дегидрогеназы. Этот фермент, имеющий мол. вес около 110 000, две молекулы связанного ФАД и состоящий из двух, по-видимому, идентичных полипептидных цепей, обнаружен в количестве 5—6 молей на моль комплекса. Даже если предположить, что каталитически активной является каждая субъединица, то и тогда его содержание в комплексе все еще оказывается низким по сравнению с двумя другими, функционально с ним связанными ферментами. Заметим, что такое же низкое содержание ли-иоилдегидрогеназы было обнаружено и в пнруватдегидрогеназном комплексе, выделенном из сердечной мышцы свиньи [206].
