Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 61

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 55 56 57 58 59 60 < 61 > 62 63 64 65 66 67 .. 86 >> Следующая

В данном разделе речь пойдет в основном о регуляторных ферментах — киназе пируватдегидрогеназы и фосфатазе пируватдегидрогеназы, выделенных из трех источников: почек быка, сердца быка и свиньи. Эти ферменты выделены в высокоочищенном состоянии и изучены наиболее полно [259, 474].
Киназа пируватдегидрогеназы. Фермент прочно связан с липоилтрансацетилазой и выделяется вместе с нею при разобщении пируватдегидрогеназного комплекса на составляющие его компоненты. Разделение может быть достигнуто обработкой п меркурибензоатом или л-мер-курибензолсульфонатом с последующим ультрацентрифугированием [327, 328]. Полученный таким образом фермент из почек однороден и имеет коэффициент седи ментацин 5,5 S. Препарат киназы, выделенный из пируватдегидрогеназного комплекса сердечной мышцы быка,
172
был неоднороден и его коэффициент седиментации не определялся.
Киназы из почек и сердца быка максимально активны при pH 7,0—7,2. Истинным субстратом киназы является, по-видимому, не свободный АТФ, а его комплекс с магнием (259]. Марганец может замещать магний в качестве кофактора энзима, показывая при этом ту же величину Km- Кальций неактивен, но и не является ингибитором данного фермента.
Фосфатаза пируватдегидрогеназы. Из сердечной мышцы свиньи (474] и быка [327] фермент очищен практически до гомогенного состояния. Ферментные препараты из ночек быка содержали, согласно данным электрофореза, примеси других белков [327J. Мол. вес всех трех ферментов был одинаков и равнялся примерно 100000. Электрофорез в полиакриламидном геле, проведенный в присутствии додецилсульфата натрия, показывает наличие одной основной белковой полосы, электрофоретическая подвижность которой соответствовала мол. весу около 100 000. Другими словами, фермент не содержит субъединиц и его молекула представлена одной полипеп-тндной цепью.
Фосфатазная активность не проявляется в отсутствие 1вухвалентных катионов. Максимальная степень активации достигается при концентрации магния около 1 • 10_2М, марганца — порядка 0,5 -10-2 М. Кобальт был наполовину менее эффективен, чем магний или марганец, а цинк вообще не активен. Кальций при относительно низких концентрациях в небольшой степени восстанавливал фосфатазную активность. При высокой концентрации кальция в среде наблюдалось ингибирование фермента, предварительно активированного магнием.
В присутствии магния оптимум pH фосфатазы из сердца свиньи и быка равен 7,1, а из почек быка — 6,7. При замене магния на марганец оптимум pH для двух последних ферментов сдвигается в щелочную сторону и становится равным 7,5—7 6.
Фосфатаза характеризуется высокой степенью специфичности. Так, например, фермент, выделенный из сердечной мышцы свиньи, отщепляет фосфор от фосфори-лированной пируватдекарбоксилазы и не действует на /г-нитрофенилфосфат, неорганический пирофосфат, аце-тилфосфат, глнцерол-1 фосфат, фосфотреонин, фосфо-
,173
рилэтаноламин, глюкозо-6 фосфат, фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат, ЛАД, АМФ, АДФ, АТФ и фос-фитии. Не действовал он и на фосфорилазу даже при использовании больших концентраций фосфатазы и продолжительном времени инкубации. Таким образом, судя по специфичности, фосфатаза пируватдеппрогеназы отличается от других хорошо охарактеризованных проте-инфосфатаз (257, 337, 349, 403 497]. Что касается истинного субстрата фосфатазы, ннруватдегидрогеназы, то, как уже говорилось выше, фермент, полученный из одной какой-либо ткани, гидролизует фосфорилированные производные пируватдекарбоксилазного компонента ии-руватдегидрогеназпых комплексов, выделенных и из других источников.
При работе с малоочнщснными препаратами фосфатазы, выделенными из сердечной мышцы свиньи, был обнаружен интересный факт. Он заключался в том, что реактивация (т. е. дефосфорилнрование) пируватдекарбоксилазы фосфатазой в значительной степени стимулировалась циклической АМФ (549]. Другие циклические нуклеотиды (циклические ЦЧФ, ГМФ, ИМФ, УМФ), а также 5‘-АМФ были неэффективны.
Для действия циклической АМФ требовалось присутствие в среде АТФ. Без него дефосфорилнрование фосфопируватдекарбоксилазы осуществлялось с одинаковой скоростью вне зависимости от того, добавлялась циклическая АМФ или нет. Создавалось впечатление, что фосфатаза пируватдегидрогеназы активируется путем фосфорилирования аденозинтрнфосфатом за счет действия специфической киназы, присутствующей в инкубационной среде, и в свою очередь активируемой циклической АМФ [549]. Тем более, что в литературе описан целый ряд киназ, осуществляющих в присутствии АТФ фосфорнлирование различных белков и подверженных влиянию циклической АМФ [93, 129, 320, 323, 358, 535].
Для выяснения возможности фосфорилирования фосфатазы фермент преинкубировали с АТФ, меченным по конечному фосфатному остатку. Оказалось, что фосфо-рилнрование фосфатазы происходит, но с очень малой скоростью, которая, однако, во много раз увеличивается при добавлении циклической АМФ [549]. Заметим, что ощутимый эффект наблюдается уже при концентрации аденозннциклофосфата, равной 1 -10-7 М. С повышением
Предыдущая << 1 .. 55 56 57 58 59 60 < 61 > 62 63 64 65 66 67 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed