Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Здесь нужно отметить два момента. Во-первых, величины константы ингибирования для пирувата значительно выше соответствующих значении константы Михаэлиса. Во-вторых, ингибиторные константы для пирувата, полученные с двумя вышеуказанными ферментными комплексами, различаются между собой примерно на порядок, в то время как величины Km, полученные с темн же комплексами, по существу имеют одно и то же значение. Поэтому следует предположить, что в ппруватдегидроге-назном комплексе имеется два типа участков связывания пирувата. К первому типу относится активный центр пируватдекарбоксилазного компонента, в котором происходит связывание молекул пирувата, подвергающихся ферментативному превращению. Второй — это «ингиби-
167
торный участок», где Связываются молекулы пирувата, снижающие скорость фосфорилирования комплекса.
Мы уже указывали выше, что константа ингибирования для пирувата с пируватдегидрогеназным комплексом из почек быка равна 0,9—2 0-10-3 М, а с пируватдегидрогеназным комплексом из мышцы сердца — 0,8—3,0-•10-4 М. Оказалось, что если к пируватдегидрогеназному комплексу из сердечной мышцы добавить (в присутствии АТФ) фосфокиназу почек, то комплекс ведет себя аналогично комплексу из почек, т. е. скорость его инактивации снижается в присутствии пирувата с величиной константы ингибирования для последнего равной примерно 1,1 -10-3 М [259].
Эти данные указывают на то, что в противоположность коферменту, который тоже предохраняет пируват-дегидрогеназный комплекс от инактивации аденозинтри-фосфатом, действие пирувата направлено не на пируват-декарбоксилазу, а на фосфокиназу. Подтверждением этому служат и опыты с казеином, сущность которых заключается в следующем: казеин, так же как и пируват-декарбоксилаза, способен фосфорилироваться киназой пируватдегидрогеназы, хотя со значительно меньшей скоростью. Пируват и а-кетобутират (субстраты пиру-ватдегидрогеназного комплекса) предотвращав фосфо-рилирование казеина, в то время как а-кетоглутарат влияния на этот процесс не оказывал [259].
Сильное ингибирование киназы пируватдегидрогеназы относительно низкими концентрациями пирувата может указывать на возможность ее регуаяции пируватом в физиологических условиях.
Влияние АДФ. Степень инактивации пируватдегидро-геназного комплекса из мозга [475] и печени [328] свиньи, из почек и сердца быка [328] аденозинтрифос-фатом снижается при добавлении в систему АДФ. Ма-лат, щавелевоуксусная, янтарная, лимонная, изолимон-ная, молочная, фосфоэнолпировиноградная, глутаминовая, аспарагиновая кислоты, а также АМФ, ГДФ, аланин, карнитин, ацетил-КоА и ацетоацетил-КоА влияния не оказывали. Действие АДФ конкурентно по отношению к АТФ и обусловлено снижением степени фосфорилирования пируватдегидрогеназного комплекса. Величины константы ингибирования для АДФ с ферментными комплексами, выделенными из ткани почек и сердца быка,
168
варьируют в пределах 1-10-4—3-10-4 М [259]. Конкурентный по отношению к АТФ характер ингибирования указывает на то, что действие АДФ направлено, очевидно, на киназу. Значительное различие в сродстве АТФ и ЛДФ к киназе (кажущаяся К* для АДФ составляет величину порядка 2-10-4 М а кажущаяся Кт для АТФ — около 2-Ю-5 М [259]) означает, что регуляция активности данного фермента путем изменения соотношения АТФ и АДФ в митохондриях вряд ли может иметь существенное значение в условиях клетки.
Участие липоилтрансацетилазы
в процессах фосфорилирования и дсфосфорилирования
Уже в первых работах, в которых исследовали инактивацию пируватдекарбоксилазы аденозинтрифосфатом, было показано, что скорость процесса повышается при добавлении в систему липоилтрансацетилазы [328, 329]. Тогда это интерпретировали таким образом, что липоил-трансацетилаза, связывая пируватдекарбоксилазу, меняет ее конформацию, которая становится более благоприятной для фосфорилирования. Последующие работы, проведенные с высокоочищепными препаратами липоилтрансацетилазы, не содержащими фосфокиназу, не подтвердили первоначатьно высказанные соображения, однако позволили выяснить истинную природу активации процесса фосфорилирования липоилтрансацетилазой.
Оказалось, что увеличение скорости фосфорилирова-пия пируватдекарбоксилазы при добавлении липоилтрансацетилазы объясняется повышением сродства пируватдекарбоксилазы к фосфокиназе: величина кажущейся константы Михаэлиса фосфокиназы для субстрата (пируватдекарбоксилазы) уменьшается более чем в 30 раз. Максимальная скорость реакции фосфорилирования при этом примерно удваивалась [259].
Липоилтрансацетилаза характеризуется способностью увеличивать не только скорость фосфорилирования пируватдекарбоксилазы, но и скорость ее дефосфорилиро-вания. Во втором случае активирующее влияние липоилтрансацетилазы исчезало при добавлении ЭГТА и опять проявлялось при последующем добавлении кальция [383]. Снижение фосфатазной активности в присутствии ком-
|69
Таблица 18
Влияние липоилтрансацетилазы (JITA), кальция и магния на активность фосфатазы пирувсипдс^идрогсназы [383]
