Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Чтобы выяснить, какой из ферментов пируватдегпд-рогеназного комплекса фосфорилируется и инактивируется под действием фосфокиназы, комплекс фосфорилн-ровали аденозинтрнфосфатом, меченным по конечному фосфатному остатку, и разделяли на составляющие его компоненты. Оказалось, что ни липоплтраисацстилаза, ни лппоилдегпдрогеназа не содержали радиоактивности. Вся она была сосредоточена в пнруватдекарбоксилазе. Молекулярнын вес и коэффициент седиментации фосфо-рилированной и нсфосфорилироваиной пируватдекарбо-ксилазы были одинаковыми [327, 329], и на моль белка приходилось два эквивалента связанного фосфора [329].
Последующее добавление магния и препарата фосфатазы сопровождалось отщеплен нем связанного фосфора п восстановлением ферментативной активности. Таким образом, было однозначно показано, что обратимому фосфорилированию и обусловленной им инактивации
162
подвергается пируватдекарбоксилазный компонент пиру-ватдегндрогеназного комплекса.
Ферменты, катализирующие фосфорилирование и де-фосфорилирование, были названы соответственно киназой пируватдегидрогеназы и фосфатазой пируватдегидро-геназы [329]. Как уже указывалось выше, пируватде-карбоксилаза, входящая в состав пируватдсгидрогеназ-ного комплекса грудной мышцы голубя и почек быка, состоит из четырех субъединиц, две из которых (а-субъ-единицы) имеют молекулярный вес примерно по 42 000, две другие ((3-субъединицы)— по 37 ООО. При добавлении у-Р32 — АТФ (при наличии в среде иируватдегидрогена-зы-киназы) происходит фосфорилироваипс пнруватде-карбоксилазы. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле дал возможность идентифицировать белковую фракцию, содержащую связанный с белком радиоактивный фосфор. Оказалось, что электрофоретическая подвижность радиоактивной фракции соответствует по-липептидпой цепи с мол. весом 42 000, тогда как фракция с мол. весом 37 000 была неактивна [84]. Таким образом, под действием киназы фосфорнлнруются toilko ос-субъединицы пируватдекарбоксилазы. Это соответствует набтюдению, что при фосфорнлированни пируватдекарбоксилазы с ферментом связываются два фосфатных остатка на молекулу белка [329].
В первых опытах, в которых исследовали фосфорилн-ровапие пируватдекарбоксилазы, было иоказапо, что дтя инактивации (и фосфорилнровання) фермента из почек быка адснозинтрифосфатом добавления киназы не требовалось [329]. Создавалось впечатление, что киназа связана с пируватдекарбоксилазой и вместе с ней выделяется из пируватдегидрогеназного комплекса. Однако нельзя было исключить, что эти два фермента имеют очень близкие физико-химические свойства и не полностью разделяются теми методами, которые использовали для выделения н очистки пируватдекарбоксилазы.
Для выяснения этого вопроса из сердца быка и печени свиньи были выделены высокоочищенные пируватдегпд-рогеиазные комплексы, которые характеризовались очень низкой киназной активностью. В то же время пируватде-гпдрогеназнын комплекс почек быка, характеризующийся высокой киназной активностью, был разобщен на составляющие его компоненты, и получили две отдельные
163
6*
Таблица 16
Инактивация пируватдегидрогеназных комплексов, выделенных из печени свиньи и сердечной мышцы быка, под действием киназы пируватдсгидролназы, выделенной из почек быка [329]
Во все пробы добавляли АТФ
Источник получения Добавлено Снижение фермента-
пнруватдегидрогеназ- тив юП активности.
пого комплекса % от исходноП
(до добавления АТФ)
Почки быка Без добавок 79
Печень свиньи Без добавок 8
То же Липоилтрансацетилаза * 82
Сердечная мышца Без добавок 14
быка
То же Пируватдекарбоксилаза * 17
» Липоилтрансацетилаза * 87
» Кина а шфунатдегидрогена- 71
зы *
* Выделена из почек быка.
фракции, содержавшие соответственно ппруватдекарбо-кснлазу и липоилтрансацетилазу. Использование сефаро-зы в процессе выделения и очистки лнпои птрансацетила-зы исключало возможность загрязнения данного фермента (мол. вес около 3 ООО ООО [84]) низкомолекулярны-мн белками, каким могла быть пнруватдегпдрогеназа-киназа.
Как следует из данных, приведенных в табл. 16, пиру ватдегидрогеназный комплекс из печени и мышцы сердца лишь в незначительной степени инактивируется при добавлении АТФ. Степень инактивации во много pa.i увеличивается при добавлении в систему наряду с АТФ препарата лппоилтрансацетилазы, выделенной нз пируватдегидрогеназного комплекса почек, и становится сопоставимой со степенью инактивации нативного пируватдегидрогеназного комплекса почечной ткани. В то же время добавление в систему пируватдекарбоксилазного компонента пируватдегидрогеназного комплекса почек практически не даст никакого эффекта.
