Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Амид пировиноградной кислоты представляет собой близкий структурный аналог пирувата, но не может его замещать в качестве субстрата пируватдегидрогеназного комплекса. Ферментативная активность комплекса снижается при высоких концентрациях аналога и повышается при низких его концентрациях. Активирующий эффект проявляется в том, что кривая зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации пирувата приобретает гиперболическую форму (в противополож ность сигмоидальной — в отсутствие аналога [52]). По мнению авторов, взаимодействие амида пировиноградной кислоты с пируватдегидрогеназным комплексом происходит в его субстрат-связывающих участках.
159
Приведенные экспериментальные данные указывают на то, что как и в случае пируватдекарбоксилазы, о чем говорилось в начале настоящей главы, пировиноградная кислота, помимо своей основной функции (субстратной), выполняет и регуляторную функцию, являясь аллосте-рическим активатором пируватдегидрогеназного комплекса.
Фосфорилирование — дефосфорилирование пируватдегидрогеназного комплекса
На рис. 43 представлены результаты опытов по определению влияния АТФ на активность пируватдегидрогеназного комплекса, выделенного из почек быка. Отчетливо видно резкое снижение ферментативной активности комплекса уже при концентрации АТФ, равной 1-10“® М (кривая 2). С увеличением концентрации скорость инактивации повышается, и при наличии в среде I -10~* М АТФ (кривая 5) фермент почти полностью инактивируется менее чем за 2 мин. Активность заингибированного пируватдегидрогеназного комплекса не восстанавливается ни при разведении, ни после диализа, ни после гель-фильтрации. Из всех других исследованных нуклеотидов лишь ИТФ вызывал слабое ингибирование. АМФ, АДФ, ЦТФ и УТФ (взятые в концентрации МО-3 М) были неэффективны [329]. Аналогичные результаты получены и для пируватдегидрогеназного комплекса из сердечной мышцы свиньи [547].
Ингибирование под действием АТФ сопровождается фосфорилированием пируватдегидрогеназного комплекса (рис. 44). При максимальной степени фосфорилирования (кривая /) наблюдается полная потеря ферментативной активности (кривая 2). При использовании АТФ, меченного по фосфору, количество радиоактивности, включенной в белок, было примерно в два раза больше в опытах с у-Р32 — АТФ по сравнению с опытами, где добавляли Р, Y'P32 — АТФ (оба препарата АТФ имели одинаковую удельную радиоактивность). Включения радиоактивности в белок из а-Р32— АТФ не происходило [329]. Отсюда следовало, что на пируватдегидрогепазный комплекс переносится конечный фосфатный остаток АТФ.
Фосфорилированные и потерявшие ферментативную активность препараты пируватдегидрогеназного комплекса могут быть реактивированы добавлением ионов маг-
160
Рис. 43. Влияние ЛТФ на активность иируватдегидрогсиаз* пого комплекса, выделенного из почек быка [329]
По оси ординат—величина ферментативной активности в % от исходной. Концентрация ЛТФ (М):
I _ о.О; 2 — I-10-* М; 3-5-10-* М; 4 — ЫО-51; 5—110-*: 6 -МО-3 М
Рис. 44. Фосфорилирование и цефосфорилирование пируват-дегидрогеназного комплекса, чыделсиного из почек (с) и сердечной мышцы (в) быка и печени свиньи (б) [328, 329]
По оси ординат — ферментативная активность и включение метки ил у.ззр.АТФ в белок (в % от максимальных значений); 1—включение метки в белок; 2 —ферментативная активность. Стрелками указан момент добавления хлористого магния
%
ния (оптимальная концентрация ЫО-2 М). Восстановление ферментативной активности сопровождается потерей белком радиоактивности (см. рис. 44) и выделением в среду неорганического ортофосфата [329].
Добавление магния оказывалось эффективным не во всех случаях. Были препараты, для реактивации которых требовалось наряду с магнием добавить еще термолабильную белковую фракцию, полученную в качестве
6 Г А Кочетов
161
побочного продукта на последних стадиях очистки ипру-ватдегидрогеназиого комплекса [329].
Приведенные выше данные указывали на то, что фос-форилирование и дефосфорилнрование (и соответствующие им инактивация и реактивация) пируватдегидроге-иазпого комплекса осуществляются двумя различными ферментами — АТФ-спецпфичиой киназой и фосфатазой, для действия которой необходим магнии, и что эти ферменты входят в состав нируватдегндрогеназпых комплексов.
Как следует из данных, приведенных па рис. 44, инактивация пируватдегидрогеназного комплекса из сердца быка аденозинтрнфосфатом происходит значительно медленнее, чем соответствующих ферментных комплексов, выделенных из печени свиньи и почек быка. В то же время реактивация (и дефосфорилнрование) в первом случае, наоборот, осуществляется быстрее. Объясняется это тем, что содержание (или удельная активность) фос-фокиназ и фосфатаз в пируватдегидрогеназных комплексах, выделенных из разных источников, неодинаково. Отсутствие фосфатазы в некоторых препаратах пируватдегидрогеназного комплекса при наличии в них фосфокн-назы свидетельствует в пользу того, что фосфатаза менее прочно связана с комплексом и частично (или полностью) отщепляется в процессе его выделения и очистки.
