Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Препараты пируватдекарбоксилазы, выделенные из различных порций пивных дрожжей, как правило, имеют неодинаковую удельную активность. Отличаются они и по свойствам. На рис. 12 кривая / по пучена па основании опытов, проведенных с высокоочищепньш ферментом (уд. активность 80 Е/мг белка). Кривая 2 получена с менее активным препаратом (уд. активность 45—50 Е/мг белка). В последнем случае коэффициент Хипла равен примерно 2 лишь при использовании относительно низких концентраций субстрата. В области относительно высоких концентраций он снижается до 0,9. Резкий перегиб кривой наблюдается при концентрации пирувата, равной 3* 10_3 М (рис. 42, кривая 2).
Авторы [510] поаагают, что неодинаковые свойства различных препаратов пируватдекарбокситазы могут
156
А Я366/мин ь
1 16
S - Jу>
? О If
f 0,3 7
3 / <г
¦ / -/ /
/ 1 0.1 7 ¦г -/
1- 1 о r?\ 1 1
О 10 30 [5], им ~Z
Lg[5j
Рис. 41. Зависимость скорости иируватчекарбоксилазнои реакции от концентрации субстрата [510]
Рис. 42. Зависимость скорости пируватдекарбоксилазнон реакции от концентрации пирувата (данные представлены в координатах Хилла) [510]
/ — ферментный препарате высокой удельной активностью; 2 — ферментный препарат с невысокой удельной активностью
быть объяснены различными условиями выращивания отдельных порций дрожжей, из которых эти препараты фермента выделяли. Такое заключение делается по ана-.югии с литературными данными [191], сущность которых сводится к следующему. Коэффициент Хилла для цитоплазматической пируватдекарбоксилазы Е. coli равен 1,9, если бактерии выращивали в среде, содержавшей магний в высокой концентрации (М0“3 М). При низком содержании магния в среде выращивания (3-10"в М) коэффициент Хилла равнялся 0,9 Та же величина определялась и в том случае, если бактериальные клетки, выращенные на среде с высоким содержанием магния, перед исследованием подвергали тепловой обработке.
В какой степени можно проводить аналогию между фожжамн и клетками Е. coli — покажут дальнейшие исследования.
157
Наличие, как минимум, двух участков связывания субстрата в молекуле пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей показано и в лаборатории Хесса [96]. Величина коэффициента Хилла была определена равной 1,37 при использовании пирувата в широком диапазоне концентраций, независимо от того, проводилась ли работа с дрожжевыми экстрактами или с очищенными препаратами фермента. Степень кооперативности, однако, резко изменялась в присутствии неорганического фосфата. При его концентрации, равной 2,5-10-2 М и МО-1 М, коэффициент Хилла увеличивался соответственно до 1,9 и 2,13. Увеличивалась и величина константы Михаэлиса для пирувата: от 1,3-10_3 М в отсутствие фосфата, до 1,1 • 10-2 М при его концентрации, равной 1 • 10~* М. Таким образом, сродство субстрата к ферменту уменьшалось почти на порядок. Максимальная скорость реакции при этом не изменялась [96].
Интересно заметить, что константа ингибирования для фосфата равна 2,5-10—3 М [96] —величина того же порядка, что и Кп, для пирувата (1,3 -10-3 М). Примерно одинаковое сродство пируватдекарбоксилазы к субстрату и к ингибитору (концентрация которого в клетке подвержена резким изменениям в зависимости от интенсивности и направленности различных ферментативных процессов) может указывать на возможные пути регуляции данного фермента в дрожжах.
В противоположность фосфату амид пировиноградной кислоты повышает в условиях низкой концентрации субстрата пируватдекарбоксилазную активность [252, 434, 435]. Он уменьшает степень сигмоидальности кривой зависимости величины активности пируватдекарбоксилазы от концентрации пирувата, приближая ее к гиперболической форме. Аналогичное влияние, хотя и в меньшей степени выраженное, оказывает амид а-кето-масляной кислоты.
Ни одно из указанных соединений не является ни субстратом пируватдекарбоксилазы, ни конкурентным ингибитором. Авторы полагают, что в молекуле пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей наряду с активным центром имеется регуляторный центр, взаимодействие с которым и дает те изменения ферментативной активности, о которых говорилось выше.
158
ПИРУВАТДЕГИДРОГЕНАЗИЫЙ КОМПЛЕКС ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ
Пировиноградная кислота как эффектор в пируватдегидрогеназной реакции
При относительно низких концентрациях пирувата зависимость скорости ферментативной реакции, катализируемой пируватдегидрогеназным комплексом, выделенным из грудной мышцы голубя, от концентрации субстрата не подчиняется закону Михаэлиса-Ментен. Кривая имеет S образную форму [52], что свидетельствует об аллостерических взаимоотношениях между центрами связывания пирувата пируватдегидрогеназным комплексом. Коэффициент Хнлла оказался равным 1,5.
Отклонение от гиперболической зависимости скорости энзиматической реакции от концентрации субстрата наблюдалось и в том случае, если вместо пируватдегидроге-назного комплекса в опытах использовали ее декарбокси-лазный компонент (который и является собственно тиа-миновым ферментом, непосредственно взаимодействующим с субстратом и катализирующим начальные этапы его окислительного декарбоксилнрования). Правда, общая картина в данном случае получалась более сложная по сравнению с той, которая имела место при работе с пируватдегидрогеназным комплексом. Авторы [52] полагают, что усложнение картины во втором случае объясняется наличием в инкубационной смеси различных олигомерных форм пируватдекарбоксилазного компонента, характеризующихся различной ферментативной активностью [68].
