Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Первое положение (а косвенно и второе) подтверждается экспериментальными данными, приведенными на рис. 38. Здесь по оси абсцисс отпожена величина фер ментативной активности реконструируемой транскетолазы, определяемой в отсутствие добавленных извне кофакторов (она отражает связывание каталитически активных молекул кофермента), а по оси ординат — соответствую щее изменение величины оптической плотности при 320 нм, характеризующее образование комплекса с пероносом заряда. Из рис. 38 видно, что между указанными величинами наблюдается четкая линейная зависимость,
149
и при максимальной активности реконструированного холофермента изменение оптической плотности также максимально.
Как будет показано дальше, с молекулой апотранскетолазы способно связываться относительно большое количество молекул тиаминпирофосфата, причем только часть из них выполняет каталитическую функцию. Экспериментальные данные, приведенные на рис. 38, указывают на то, что комплекс с переносом заряда образуется только при связывании апоферментом каталитически активных молекул кофермента. Другими словами, его образование характеризует формирование активного центра транскетолазы.
КОЛИЧЕСТВО АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ Транскетолаза из листьев шпината
Тиаминпирофосфат в данном случае связан прочно и не отщепляется в процессе выделения и очистки фермента. Гомогенные препараты нативного фермента не активируются добавленными извне кофакторами и содержат один моль кофермента на моль белка [246, 250], другими словами — имеют один активный центр.
Транскетолаза пекарских дрожжей
Кофермент от транскетолазы пекарских дрожжей частично отщепляется уже в процессе выделения и очистки фермента [193]. Поэтому изучение связывания тиаминпирофосфата обычно проводят с препаратами фермента, предварительно разобщенными от кофермента.
Опыты по связыванию тиаминпирофосфата с транске-толазой в равновесных условиях ставили на колонках, заполненных ссфадексом G 50. Для уравновешивания использовали калий-фосфатный буфер (pH 7,6), содержавший кальций или магний — в насыщающей концентрации и кофермент — в различных концентрациях [288].
Судя по данным рис. 39, а, на котором изображены результаты экспериментов, полученных в присутствии кальция, в молекуле транскетолазы имеются два участка связывания для тиаминпирофосфата, характеризующие-
150
/ Z J r / Z r
Рис. 39. Связывание тиаминпнрофосфата с апотранскетолазой в присутствии кальция (а) и магния (б) [288]
г — число молей тиаминпнрофосфата, связанное с молем фермента; А—концентрация свободного кофермента в среде
ся достаточно низкими значениями константы диссоциации (соответственно 3,2-10-8 М и 2,5-10-7 М). При достаточно высоких концентрациях кофермента с молекулой транскетолазы может дополнительно связываться еще несколько молекул тиаминпнрофосфата, но сродство их к ферменту значительно ниже, чем первых двух.
Если связывание тиаминпнрофосфата с апотранскетолазой происходило в присутствии магния (рис. 39,6), то также можно было говорить о наличии двух «основных» участков связывания кофермента. Зависимость r/А от г в данном случае имела куполообразный характер, что указывало на положительное кооперативное взаимодействие между этими участками [125].
Для исследования «квазинеобратимого» связывания тиаминпнрофосфата препараты апотраискетолазы пре-ннкубировали с тиаминпирофосфатом и кальцием или магнием, взятыми в насыщающей концентрации. Затем пропускали через сефадекс G-50 для удаления свободных кофакторов и в ферментном препарате, снятом с колонки, измеряли содержание тиаминпнрофосфата. Кроме того, для определения степени реконструкции холотранс-кетолазы измеряли величину ферментативной активно-
151
сти без добавления кофакторов и с добавлением тиаминпирофосфата и, соответственно, кальция или магния (в зависимости от того, с каким из указанных катионов проводили предварительную инкубацию) [32].
После реконструкции холотранскетолазы в присутствии кальция ее каталитическая активность одинакова как при определении с добавлением кофакторов, так и без них. Количество тиаминпирофосфата составляет 1,6 моля па моль фермента. Очевидно, что максимальное количество тиаминпирофосфата, которое в данных условиях проведения эксперимента связывается «квазинеоб-ратимо» с апотранскетолазой и которое необходимо для проявления полной каталитической активности фермента, равно двум. Аналогичные данные были получены при реконструкции холотранскетолазы в присутствии магния [32,210].
Приведенные выше эксперименты не давали ответа на вопрос о количестве активных центров в молекуле траискетолазы, так как не было известно, все ли молекулы кофермента, связавшись с белком, выполняют каталитическую функцию. Этот вопрос пытались разрешить в лаборатории Рекера [135]. Транскетолазу инкубировали с равномерно меченным по углероду фруктозо-6 фосфатом в присутствии тиамнппнрофосфата и магния, взятыми в насыщающих концентрациях. Инкубационную смесь пропускали через анионообменпик для удаления фруктозо-6-фосфага, не вступившего в реакцию. Фермент оставался в элюатс. Он содержал связанный с тп-аминпирофосфатом гликольальдегид, образовавшийся из фруктово-6-фосфата. После дспротеинизацин определяли количественное содержание кофермента и гликольальдр-гида. Оказалось, что па моль фермента обнаруживается два эквивалента тиаминпирофосфата и 06 эквивалента глнкольальдегида, т. е. соотношение фермент: кофермент : гликольа чьдегпд равно 1 : 2 : 0,6. Таким образом, какая-то часть глнкольальдегида отщепляется от холо-фермента в процессе проведения эксперимента. Но какая часть, сказать трудно, а значит и вопрос о количестве активных центров в мочекуле траискетолазы пекарских дрожжей оставался открытым.
