Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Как видно из данных рис. 37 (кривая /), дифференциальный спектр холотранскетолазы характеризуется наличием широкой полосы поглощения в области 286— 360 нм с нечетко выраженным максимумом при 300— 310 нм и плечом при 286—292 нм, отрицательного пика с максимумом около 270 нм и положительного пика с максимумом примерно при 248 нм. Широкая полоса поглощения при 286—360 нм является результатом образования комплекса с переносом заряда при взаимодействии тиаминпирофосфата с апотранскетолазой и соответствует отрицательной полосе в спектре циркулярного дихроизма холотранскетолазы, о чем говорилось выше (см.
146
Рис. 37. Дифференциальные спектры поглощения холотранскетолазы и ее комплекса с оксипируватом [284]
I — холотраискетолаза (4.4-10-* М); 2 — то же, что и 1, но через 2 мин после добавления окснпнрувата (2 8-10-' М); 3 — то же, что и 2. ио после добавления гликолевого альдегида (4.3-10—а М)
рис. 34). Плечо при 286—292 нм объясняется, по видимому, наложением спектра пертурбации остатков триптофана (красный сдвиг полосы поглощения триптофана) на основной спектр комплекса с переносом заряда. Что касается отрицательного пика с максимумом около 270 нм, то, по аналогии с другим тиаминовым ферментом — пируватдекарбоксилазой [518], можно считать причиной его появления гипохромизм тиазолового кольца тиаминпирофосфата в результате присоединения кофермента к молекуле апотранскетолазы (в условиях постановки эксперимента — pH 7 6, тиазоловое кольцо кофермента имеет максимум поглощения при 267—269 нм [291,514]).
Добавление одного из субстратов-доноров траисксто-лазы — оксипирувата сопровождается существенными изменениями дифференциального спектра холотранскетолазы: уменьшается интенсивность широкой полосы поглощения в области 315—360 нм и величина отрицательного пика с максимумом при 270 нм (рис. 37, кривая 2). Аналогичные изменения дифференциального спектра .v> лотранскетолазы наблюдались и в том случае, когда вместо оксипирувата добавляли другой субстрат-донор — фруктозо 6-фосфат. Изменения не наблюдались, когда к холотранскетолазе добавляли субстрат-акцептор — рибо-зо-5 фосфат. Если сразу же после добавления оксипирувата добавить субстрат-акцептор — гликолевый альдегид
147
(или глюкозо-6-фосфат), то исходный спектр восстанавливается (рис. 37, кривая 3). Если субстрат-донор и субстрат-акцептор добавляются к холотраискетолазе одновременно, изменений дифференциального спектра не наблюдалось.
Изменения в указанных областях спектра при добавлении оксипирувата происходили одновременно. Очевидно, они являются отражением одного и того же процесса— образования тронного комплекса транскетолаза — тиамиипирофосфат— субстрат или транскетолаза — ти-аминпнрофосфат — «активный гликольальдегид».
Как мы уже говорили выше, появление в дифференциальном спектре холотранскетолазы отрицательного пика с максимумом при 270 нм обусловлено, по-видимо-му, гнпохроизмом тиазолового кольца тиаминпирофосфата при связывании кофермента с апотранскетолазой. Известно также, что субстраты-доноры (в том числе н оксипируват) в процессе транскетолазной реакции присоединяются к тнамннпнрофосфату по второму углеродному атому тиазолового кольца кофермента (см. главу II).' Можно поэтому полагать, что величина изменения оптической плотности при 270 нм при добавлении оксипирувата к холотраискетолазе отражает концентрацию тройного комплекса в системе.
Что касается изменений спектра холотранскетолазы в области поглощения комплекса с переносом заряда (см. рис. 37), то здесь следует сказать следующее. Как уже отмечалось выше, для образования комплекса с переносом заряда необходимо близкое расположение взаимодействующих компонентов комплекса и соответствующее, достаточно строгое, их расположение друг относительно друга. Кроме того, в рассматриваемом нами случае необходимо еще наличие положительно заряженного атома азота тиазолового кольца тиаминпирофосфата—одного из компонентов, образующих комплекс. Естественно, что такая тонкая структура будет весьма чувствительна даже к небольшим изменениям каждого из компонентов комплекса, что должно проявляться в изменении его спектральных свойств.
Поэтому уменьшение интенсивности спектра комплекса с переносом заряда, наблюдавшееся при взаимодействии оксипирувата с холотранскетолазой (а точнее — со вторым углеродным атомом тиазолового кольца ти-
148
Рис. 38. Зависимость между величиной транскетолазной активности и изменением оптической плотности при связывании тиаминпирофосфата (ТПФ) апотранскетолазой в присутствии кальция (2,3-10~3) [279]
Исходная концентрация апотраи,-ытолазы—3.57-10-® М; исходная концентрация ТПФ — 2.6- 10_в — 1,4-•Ю-" М
30 100
Яктидность, •/•
аминпирофосфата в составе холофермента) могло быть вызвано нарушением взаимной ориентации взаимодействующих компонентов, изменением электронно-акцепторных свойств тиазолового кольца кофермента пли образованием долгоживущего промежуточного комплекса, лишенного положительного заряда на атоме азота тиазолового кольца [ПО].
В настоящее время трудно сказать, какая из трех указанных возможностей реализуется в действительности. Ясно лишь то, что структура, образующаяся при взаимодействии тиаминпирофосфата с апотранскетолазой и характеризующаяся спектром комплекса с переносом заряда, является характеристикой активного центра фермента, а наблюдаемые в присутствии субстрата-донора изменения в этом спектре есть результат ферментатив пой реакции, катализируемой траискетолазой.
