Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Ни один из исследованных аналогов тиаминпирофосфата, взаимодействуя с апотранскетолазой, не вызывал появления отрицательного эффекта Коттона, как это имеет место в случае взаимодействия кофермента с апотранскетолазой (см. рис. 34). Другими словами, комплекс с переносом заряда не образовывался. Для его образования в модельной системе тиаминпирофосфат+ +триптофан необходимо наличие положительно заряженного азота тиазолового кольца тиаминпирофосфата. В опытах с ферментом это тоже подтверждается — тиазолпирофосфат, в котором положительный заряд на азоте отсутствует, действительно не образует с апотранскетолазой комплекс с переносом заряда, хотя и достаточно прочно связывается с молекулой белка. С другой стороны, тиамин и тиаминмонофосфат, которые содержат положительно заряженное тиазоловое котьцо, тем не менее также не образуют комплекс с переносом заряда с апотранскетолазой. В модельной же системе с триптофаном они образовывали комплекс, причем в такой же степени, как и тиаминпирофосфат.
Таким образом, для образования комплекса с переносом заряда в условиях фермента необходимо не только положительно заряженное тиазоловое кольцо, по и пиро-фосфатный остаток (свободный пирофосфат влияния на оптическую активность апотранскетолазы не оказывает).
Считается, что образование комплекса с переносом заряда возможно только в том случае, если ароматические кольца обоих компонентов параллельны и расположены в непосредственной близости [57]. Исходя из экспериментальных данных, полученных с аналогами тиаминпирофосфата, можно следующим образом представить себе последовательность отдельных стадий процесса образования комплекса с переносом заряда при взаимодействии кофермента с апотранскетолазой.
На первой стадии тиаминпирофосфат взаимодействует с апоферментом за счет своего пирофосфатного остат-
144
ка (возможно, что отдельные фосфатные остатки тиамин пирофосфата присоединяются к молекуле белка последовательно, но в данном случае это не меняет дела). В результате этого происходит сближение положительно заряженного тиазолового кольца кофермента с ин-долильной группой остатка триптофана в активном центре и их соответствующая ориентация (вторая стадия). Вследствие этого становится возможным их взаимодействие и происходит образование комплекса с переносом заряда (третья стадия) [27].
/ О
- ^ , ^
Приводя данную схему, мы хотели лишь подчеркнуть определяющую роль пирофосфатного остатка тиамин-пирофосфата для (или в процессе) образования комплекса с переносом заряда. Она заключается не только в том, что пирофосфатныи остаток обеспечивает прочное («квазинеобратимое») присоединение кофермента к молекуле бе ка и сближение взаимодействующих компонентов комплекса с переносом заряда — положительно заряженного тиазолового кольца и индолильноп группы остатка триптофана *. Пирофосфатный остаток тиамин-пирофосфата, ио-видимому, обеспечивает еще и соответствующую ориентацию индольной группы остатка триптофана, стабилизируя (или локально изменяя) определенную конформацию активного центра транскетолазы. Это положение находится в соответствии с экспериментальными данными, о которых говорилось выше, а именно— тиаминпирофосфат существенно стабилизирует
1 Аналогичную функцию мог бы выполнять фосфатный остаток тнаминмонофосфата, при участии которого происходит связывание тнаминмонофосфата с апотранскетолазой и который вносит существенный вклад по взаимодействие этого аналога с активным центром фермента (константа связывания для тнаминмонофосфата примерно на три порядка больше, чем для не фосфорилирован-ного тиамина). Тем не менее связывание тнаминмонофосфата с апотранскетолазой не сопровождается образованием комплекса с переносом заряда.
145
активный центр траискетолазы в процессе ее тепловой и кислотной денатурации (см. главу VI). Аналогичную функцию стабилизатора, хотя выраженную в меньшей степени, выполнял и свободный пирофосфат (эти данные получены при исследовании тепловой инактивации апотранскетолазы), в то время .чак'в присутствии тиамин-монофосфата никакой стабилизации не наблюдалось — фермент инактивировался в тякой же степени, как и в отсутствие тиаминмонофосфата.
Как уже указывалось выше, комплекс с переносом заряда образуется только в системе тиамиипирофос-фат+апотранскетопаза. Ни один из исследованных аналогов кофермента, взаимодействуя с апоферментом, не дает образования комплекса с переносом заряда. В то же время все эти аналоги, хотя и связываются с апотранскетолазой, каталитическую функцию не выполняют. Отсюда вытекало предположение, что комплекс с переносом заряда играет определенную роль в осуществлении ферментативной реакции, катализируемой транскетола-зой. Вопрос этот был экспериментально исследован [284].
Дифференциальный спектр холотранскетолазы изображен на рис. 37 (кривая /). Снимался он с использованием четырех кювет. В две из них помещали соответственно апотранскетолазу + тиаминпирофосфат в буфере и раствор буфера, а в две другие — соответственно апо-транскетолазу в буфере и тиаминпирофосфат в буфере. Полученный дифференциальный спектр отражал, таким образом, те изменения в поглощении, которые возникали в результате взаимодействия кофермента с апоферментом.
