Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 50

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 86 >> Следующая

Таким образом, отрицательный эффект Коттона возникает только при взаимодействии кофермента с апотранс-кетолазой и обусловлен, по-видимому, появлением центра асимметрии в результате образования одной из связен тиаминпирофосфата с апоферментом (сам тиамин-пирофосфат оптической активности не имеет).
На рис. 35, а, б изображены спектры поглощения соответственно тиаминпирофосфата (кривая /), апотранс-кетолазы (кривая 2) и холотранскетолазы (кривая 3) в интервале 255^380 нм и, кроме того, приведена кривая,
141
являющаяся алгебраической суммой кривых для тиаминпирофосфата и апотранскетолазы (кривая 4). Разностный спектр изображен на рис. 35, в. Видно, что в результате взаимодействия с коферментом поглощение апотранскетолазы в области 298—380 нм увеличивается.
Аналогичные изменения наблюдались и в модельной системе при взаимодействии тиаминпирофосфата со свободным триптофаном (рис. 36). При замене триптофана другими аминокислотами — тирозином, фенилаланином или гистидином, взятыми в разной концентрации и в различных соотношениях с тнаминпирофосфатом, никаких изменений в спектрах поглощения не было обнаружено [63, 281]. Взаимодействие тиаминпирофосфата с триптофаном (но не с другими аминокислотами) в модельной системе было показано также методом циркулярного дихроизма [215] и ядерно-магнитного резонанса [92, 353, 422].
Таким образом, в обоих случаях — и в модельной системе (тиаминпирофосфат+триптофан) и в опытах с ферментом (тиаминпирофосфат+апотранскетолаза)—отмечается появление новой полосы поглощения, которой не было у исходных компонентов и которая возникает при их взаимодействии. Эта полоса (см. рис. 35, в и 36, б) имеет диффузный характер, нечеткий максимум поглощения и длинный «хвост», простирающийся в видимую область спектра.
Исходя из литературных данных, полученных с НАД-зависимыми ферментами, а также в модельных системах с такими коферментами, как НАД, ФМН и ФАД [13, 57, 124, 365, 398, 472], можно считать, что характерные изменения спектра, наблюдавшиеся в системе апотранскетолаза+тиаминпирофосфат (аналогичные изменениям спектра в модельной системе триптофан + тиаминпирофосфат), отражают образование комплекса с переносом заряда при взаимодействии тиаминпирофосфата с апо-транскетолазой. Функцию донора в этом комплексе выполняет индолильная группа остатка триптофана белка, а функцию акцептора — молекула тиаминпирофосфата. Все это указывает на то, что наряду с остатком гистидина (о чем говорилось выше) одной из функциональных групп, входящих в состав активного центра транскетолазы и участвующих в присоединении тиаминпирофосфата к апоферменту, является остаток триптофана. Дан-
142
ное заключение нашло подтверждение в работе Хайнриха и сотр. [213], показавших, что модификация двух остатков триптофана в молекуле апотранскетолазы сопровождается инактивацией фермента. Каталитическая активность холотранскетолазы в тех же условиях оставалась неизменной; не нарушалась и целостность остатков триптофана.
При исследовании в модельных системах методом ядерно-магнитного резонанса было показано [92, 354], что необходимое условие образования комплекса между свободным триптофаном (или различными индолилпро-изводными) и тиаминпирофосфатом — наличие в молекуле кофермента положительно заряженного азота ти-азолового кольца. Аналоги тиаминпирофосфата, в которых азот в третьем положении тназолового кольца был лишен положительного заряда, теряли способность взаимодействовать с триптофаном. Пиримидиновое кольцо тиаминпирофосфата, имеющее в сильно кислой среде (pH 3,0) положительно заряженный азот, стоящий в первом положении, взаимодействовало с триптофаном. При более высоких значениях pH взаимодействие было, однако, слабым и основной вклад во взаимодействие тиаминпирофосфата с триптофаном давало положительно заряженное тиазоловое кольцо. Пирофосфатный остаток лишь незначительно влиял на образование комплекса тиаминпирофосфат— триптофан, и свободный тиамин взаимодействовал с триптофаном практически так же, как и его пирофосфорилированное производное.
•Для выяснения условий образования комплекса с переносом заряда в процессе присоединения кофермента к апотранскетолазе были исследованы изменения спектра циркулярного дихроизма апофермента при его взаимодействии с различными аналогами тиаминпирофосфата и сопоставлены с изменениями, характерными для холо-фермента. Все опыты, как и предыдущие, ставили в присутствии кальция. Отметим, что все исследованные аналоги кофермента, так же как и тиаминпирофосфат, были оптически неактивны.
Усиление положительного эффекта Коттона в спектре циркулярного дихроизма апотранскетолазы наблюдаются (показано на рис. 34) не только при добавлении тиаминпирофосфата, о чем уже говорилось выше, но и при добавлении тиаминмонофосфата или тиамина, т. е.
143
наличие пирофосфатной группы в данном случае необязательно. Но обязательным является наличие положительно заряженного азота в третьем положении тиазолового кольца или пиримидиновой части молекулы кофермента (возможно — и того и другого одновременно), так как тиазолпирофосфат (V) изменений в спектре циркулярного дихроизма не вызывает (см. рис. 34).
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed