Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 48

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 42 43 44 45 46 47 < 48 > 49 50 51 52 53 54 .. 86 >> Следующая

Изменения спектра циркулярного дихроизма пиру-ватдекарбокснлазы наблюдались только в том случае, если тиаминпирофосфат и магний добавляли к апофер-менту вместе. Раздельно они .никакого эффекта не давали. То же самое было показано раньше для возможности образования стабильного каталитически активного холофермента [433, 438]. Таким образом, характерные изменения спектра циркулярного дихроизма, описанные выше, отражают процесс формирования активного центра пируватдекарбоксилазы.
При взаимодействии тиохромпирофосфата с апопируватдекарбоксилазой пивных дрожжей наблюдается сдвиг максимума его флуоресценции в более короткую область спектра (рис. 31). Коротковолновый сдвиг мак* симума флуоресценции наблюдается и в модельной
Рис. 31. Паменешк* спектра флуоресценции тиохромииро-фосфата при его взаимодействии с апопируватдекарбокси-лазой пивных дрожжей в присутствии (Ионов магния [554]
/ — тнохромлнрофосфат; 2 — алопп руватдекарбоксилаза + магний + + тиохромпирофосфат
системе при понижении диэлектрической постоянной среды, в которую помещен тиохром. Поэтому результаты, представленные ,на рис. 31, можно интерпретировать таким образом, что при связывании с апоферментом тио-хромпирофосфат попадает из водной среды в аполярное окружение.
Аналогичные данные о гидрофобном характере активного центра пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей были получены и при использовании 2-я-толуиднно-чафталин-6-сульфоновой кислоты (ТНС). Это соединение характеризуется тем, что, во-первых, имеет тенденцию связываться почти исключительно в гидрофобной области белка и, во-вторых, слабо флуоресцируя в водной среде, очень сильно флуоресцирует в аполярном окружении [148, 348» 492].
Действительно, оказалось, что флуоресценция ТИС во много раз увеличивается при добавлении пнруватде-карбоксилазы, причем интенсивность флуоресценции в системе ТНС + апопируватдскарбокснлаза примерно в два раза выше, чем в системе ТНС + холопнруватдекар-боксилаза (см. ниже).
Добавление тиаминпирофосфата и магния к системе ТНС + апопируватдекарбоксплаза сопровождается снижением флуоресценции в два раза [511]. Отсюда делается вполне логичное заключение, что половина всего количества ТНС, связанного с апоферментом, локализована в участке активного центра, связывающего тиамннпи-рофосфат, или в непосредственной близости от него [511].
1 яп
Состав проб
Лпопируватдекарбоксилаза магний -|- ТПФ ТНС Апопируватдекарбоксилаза + ТНС Лпопируватдекарбоксилаза + магний + ТНС Лпопируватдекарбоксилаза + ТПФ + ТНС Апопируватдекарбоксилаза -f- магний + ТПФ Магний + ТПФ + ТНС
Холопируватдекарбоксилаза (нативная) + ТНС Холопируватдекарбоксилаза
При добавлении пирувата к смеси ТНС и пируватдекарбоксилазы наблюдалось резкое уменьшение интенсивности флуоресценции [511]. Создавалось впечатление, что субстрат пируватдекарбоксилазы и ТНС связываются с одним и тем же участком фермента. Действительно, в опытах, где исследовали влияние флуоресцентного индикатора на пируватдекарбокенлазную активность, был показан конкурентный характер взаимоотношений между ТНС и пируватом за субстрат-связывающий участок пируватдекарбоксилазы [511]. Гидрофобный характер субстрат-связывающего участка пируватдекарбоксн-лазы хорошо объясняет известный ранее факт, что многие а-кетокислоты с более длинной углеродной цепочкой, чем у пирувата, имеют более высокое по сравнению с ним сродство к пируватдекарбоксилазе, хотя и декарбо-кснлнруются с более низкой скоростью[528]: большая алкильная группа у этих субстратов характеризуется боть-шей липофильностью, а значит, и лучше связывается в гидрофобном участке активного центра.
Исследование кинетики взаимодействия ТНС с пиру-ватдекарбоксилазой [46] показало, что в апоферменте имеются три участка связывания флуоресцентного индикатора (рис. 32, кривая 2). Оди,н из них связывает ТНС настолько быстро, что оказывается полностью насыщенным до того, как начинается измерение флуоресценции. Взаимодействие ТНС со вторым участком можно уже наблюдать во времени, в то время как скорость взаимодействия ТНС с третьим участком очень низкая. В холо-ферменте не проявляется второй участок связывания ТНС (см. рис. 32, кривая /), который, по-видимому, является кофермент-связывающим участком молекулы пируватдекарбоксилазы. Если принять, что третий участок.
Интенсивность фл уоресценции
19.7
41.8 41,5 42,2
0,5
1,3
18.8 0,9
137
Рис. 32. Связывание ТИС препаратами пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей [46]
I — холофермент; 2 — апофермент
наиболее медленно взаимодействующий с флуоресцентным индикатором, становится для него доступным только после обработки фермента большими концентрациями ТНС (возможно, в результате денатурации белка) [46], тогда первый, наиболее быстро взаимодействующий — это участок связывания субстрата.
Как уже указывалось выше, интенсивность флуоресценции в системе ТНС + нативная апопируватдекарбок-енлаза снижается наполовину при добавлении тиаминпирофосфата. За счет добавления субстрата оставшуюся величину фтуоресценции можно снизить практически до нуля [511]. Другими словами, взаимодействие данного флуоресцентного индикатора с нативной апопируват-декарбоксилазой осуществляется таким образом, что он связывается только в активном центре. Вся остальная поверхность нативного фермента, по-видимому, гидрофильна, несмотря на то, что примерно половина всех аминокислотных остатков липофильна [517].
Предыдущая << 1 .. 42 43 44 45 46 47 < 48 > 49 50 51 52 53 54 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed