Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
131
5*
среде фосфата. Без него активность почти не восстанавливалась.
Эффективность восстановления каталитических свойств фермента в значительной степени зависела от природы металла (без металла активация вообще отсутствовала) . С одной и той же концентрацией кофермента активность с магнием в несколько раз выше, чем с кальцием.
Связь тиаминпирофосфата с апопируватдекарбокси-лазой, выделенной из ткани мозга, нестабильна. Пропускание холофермента, реконструированного в присутствии избыточных концентраций тиаминпирофосфата и магния, через сефадекс даже в оптимальных условиях (pH 9,6, в присутствии фосфата) сопровождается значительным снижением активности, определяемой без добавления кофакторов. Авторы полагают [48], что крайняя нестабильность связи между апопируватдекарбоксилазой п тиаминпирофосфатом в физиологических условиях, возможно, является причиной того, что тнаминовый авитаминоз обычно наиболее остро проявляется в мозговой ткани.
Глава восьмая
АКТИВНЫЙ ЦЕНТР
СТРУКТУРА АКТИВНОГО ЦЕНТРА ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ
При 180—220 нм не наблюдается различий в спектрах поглощения аио- и холопируватдекарбоксилазы пив ных дрожжей. Они обнаруживаются в области 240— 300 нм. Особенно отчетливо это видно в экспериментах, где снимались дифференциальные спектры (рис. 29). Из данных рис. 29 следует, что при образовании холофер-мента увеличивается поглощение при 250 нм (максимум) с одновременным уменьшением поглощения при 230— 237 нм. Известно, что тиаминпирофосфат за счет своей аминопирнмидиновой части имеет один из максимумов поглощения при 233 мм [518]. При смещении pH от 6,8 в кислую сторону азот, находящийся в первом положении пиримидинового кольца кофермента, протонируется и максимум сдвигается к 246 нм [351, 514]. Поэтому наличие в разностном спектре холопируватдекарбоксилазы положительного пика при 250 нм и отрицатетьного — при 233 нм можно объяснить сдвигом максимума поглощения кофермента в результате протонпрования Г-N-атома тиаминпирофосфата при взаимодействии последнего с апоферментом. Аналогичные изменения спектра должны наблюдаться и при образовании комплекса между магнием и l'-N-атомом тиаминпирофосфата. В ферменте обе эти возможности (протонирование азота и взаимодействие его с магнием), по-видимому, могут реализовываться, так как характерные изменения спектра в области 230—270 нм, о которых только что говорилось, наблюдаются и в присутствии магния, и в его отсутствие, причем во втором случае величина изменений наполовину меньше [518]. Последующее добавление магния восстанавливает ту картину, которая получалась при одновременном добавлении тиаминпирофосфата и маг-
133
Рис. 29. Изменение спектра поглощения при взаимодействии апопируватдекарбоксилазы пивных дрожжей с тиаминпирофосфатом и магнием при pH 6,8 [518]
[в']
Рис. 30. Спектр циркулярного дихроизма пирупатдскарбоксилазы пивных дрожжей в среднем ультрафиолете [518]
/ — апофермент; 2 — холофермент
ния к апофермонту. Один магний, без кофермента, влия ння на спектральную характеристику апопируватдекар боксилазы в указанной области спектра не оказывает.
Шелленбергер, работая с тем же ферментом и исследуя взаимодействия с .ним различных аналогов тнамин-пирофосфата, пришел к выводу, что данный фермент имеет, как минимум, два центра связывания для кофермента (или два вида молекул апофермента), отличных один от другого [433]. Аналогичные высказывания о неравноценности участков связывания тиаминпирофосфата встречались в литературе и ранее [361]. Приведенные выше данные о влиянии магния на величину спектральных изменений, наблюдаемых при взаимодействии кофермента с апоферментом, подтверждают такую точку зрения. В да пеком ультрафиолете спектры циркулярного дихроизма апо- и холопнруватдекарбоксилазы практически идентичны. Можно заметить лишь небольшие различия в максимуме при 195 нм [518], что, по-впдимо-
MI
му, объясняется неодинаковой пертурбацией остатков ароматических аминокислот, которые сильно поглощают в этой области спектра. Существенные различия наблюдаются в среднем ультрафиолете (рис. 30). Апопнруват-декарбоксилаза имеет отрицательный эффект Коттона в области поглощения ароматических аминокислот (кривая 1). Добавление магния и тиамннпирофосфата сопровождается увеличением эффекта Коттона почти в хвое и появлением нового, положительного эффекта Коттона при 262—263 нм (кривая 2), которого не было в апофер-менте.
Известно, что тиамининрофосфат за счет наличия в нем тиазолового кольца имеет один из максимумов поглощения при 267 нм. Молекула кофермента сама по себе оптически неактивна, но становится, по-видимому, оптически активной при взаимодействии с апофермен-том, попадая в асимметричное окружение белковой молекулы. Этим можно объяснить возникновение индуцированного положительного эффекта Коттона в холопи-руватдекарбоксилазе при 262—263 нм. Причин несовпадения положительного максимума циркулярного дихроизма с максимумом поглощения тиазолового кольца тиамннпирофосфата может быть две. Первая — влияние сильно отрицательного максимума в области поглощения ароматических аминокислот (рис. 30, кривая 2), вторая — слабый сдвиг максимума поглощения тиамннпирофосфата при его взаимодействии с активным центром фермента.
