Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
120
сти образования холофермента, установленный ранее [415, 433, 438, 442J.
Результаты, иочученные с тиохромнирофосфатом, а также отсутствие коэнзимной активности у тиамина и тиаминмонофосфата [78, 179, 180, 182] и ингибирующее действие пирофосфата [552] указывают на существенную роль пнрофосфатиого остатка во взаимодействии кофермента и апофермента, с образованием стабильного холофермента.
На основании опытов с тиохромпирофосфатом и тио-хромом, о которых говорилось выше, предполагается, что связь пирофосфатного остатка с белком может быть опосредована через ион металла [554]. На основании имеющихся литературных данных трудно сказать, с чем же в действительности связывается металл в холофермеите — с пирофосфатным остатком тиаминпирофосфата или с атомом азота в первом положении пиримидинового кольца [432]. Не исключена реализация обеих этих возможностей.
Подводя итог рассмотрению литературных данных, посвященных изучению функциональной роли отдельных участков молекулы тиаминпирофосфата, можно сказать следующее. Непосредственное участие в катализе принимают второй углеродный атом тиазолового кольца и аминогруппа в четвертом положении пиримидинового кольца кофермента. Существенное влияние на реакцион-носпособность второго углеродного атома оказывают пиримидиновое кольцо [106, 379] и р-оксиэтнльная группа тиаминпирофосфата [37, 376, 418]. Для нормального осуществления каталитической функции молекула кофермента должна быть соответствующим образом ориентирована и иметь строго определенную пространственную конфигурацию. Поэтому даже небольшие изменения в структуре тиаминпирофосфата сопровождаются резким нарушением его коферментных свойств.
В связывании кофермента с апоферментом участвуют атом азота в первом положении пиримидинового кольца, 4- и 2'-метильные, а также пирофосфатная группы. Необходимо, кроме того, наличие метиленового мостика. Его удлинение даже на одну метиленовую группу дает производное кофермента, которое неактивно и не связывается с ферментом [439]. Что касается атома серы тиазолового кольца, то трудно сказать что-либо определенное
121
относительно ее функции. Опыты с имидазольным аналогом (производное тиаминпирофосфата, в котором тпазо-ловое кольцо заменено на импдазольное) мало что дают и этом смысле. Правда, показано, что он неактивен, а по прочности связи с белком почти не отличается от нативного кофермента [445], но из этого еще не следует, что атом серы участвует в катализе. Дело в том, что в ими-дазолыюм аналоге понижена кислотность атома водорода при втором углероде и, кроме того, отсутствует четвертичный азот, который есть в неизменном коферменте и который, очевидно, необходим для коэнзимной активности тиаминпирофосфата. Все же имеющиеся литературные данные позволяют с большой долей вероятности утверждать, что в стабилизации связи тиаминпирофосфата в холоферменте сера участия не принимает, но в катализе ее роль отрицать нельзя [34].
Отметим, что сере тиазолового компонента отводится определенная роль при протеидизации тиамина в тканях организма [39, 43, 44].
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОФАКТОРОВ
С ПП'РУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗОП ПИВНЫХ ДРОЖЖЕП
Многие ферменты, которые не теряют тиаминиирофос-фат в процессе выделения и очистки, достаточно легко диссоциируют на апофермент и кофермент при смещении pH в щелочную сторону. Исходя из необратимости связывания кофермента с апоферментом в нейтральной или слабокислой среде (при пропускании через сефадекс тиаминпирофосфат не отщепляется от холофермента), следовало ожидать восстановления ферментативной активности при переходе к исходным условиям, т. е. образования холофермента при подкислении раствора. Но этого не происходило, что нельзя было объяснить нарушением структуры апофермента, так как каталитическая активность фермента восстанавливалась при последующем добавлении тиаминпирофосфата.
Добавлять его требовалось, однако, в значительном избытке, на несколько порядков превышающем первоначальную его концентрацию. Стабильность реконструированного фермента не отличалась от стабильности нативного фермента: пропускание через сефадекс для ^ т,але-
122
ния свободного кофермента не изменяло величины опре деляемой активности. Указанный феномен в свое время был назван «большой загадкой рееннтеза». Для пируват-декарбоксилазы пивных дрожжей эту загадку удалось разрешить в лаборатории Шелленбергера (433, 438, 443, 448]. В опытах использовали фермент, лишенный тиаминпирофосфата. За процессом реконструкции (образования холофермеита) следили по величине ферментативной активности. Было показано, что при низкой концентрации тиаминпирофосфата его взаимодействие с апоферментом осуществляется медленно. При повышении концентрации скорость реконструкции холофермеита увеличивалась, однако до определенного предела, после которого дальнейшее повышение концентрации кофермента влияния не оказывало. Удалось рассчитать константу диссоциации двойного комплекса апопируватдекарбокси-лаза — тиаминпирофосфат. Она оказалась равной 6,5-¦ 10-4 М и не зависела от концентрации магния в системе. Для константы диссоциации двойного комплекса апопи-руватдекарбоксилаза — магний была получена величина 1,13-10~3 М, которая в свою очередь не зависела от концентрации в растворе кофермента. Таким образом, оба первичных процесса реконструкции — присоединение магния и тиаминпирофосфата к активному центру апофермента— осуществляются независимо один от другого. Двойные комплексы тиаминпирофосфата и магния с апоферментом нестабильны н легко распадаются на исходные компоненты при пропускании через ссфадекс. Тройной комплекс магний — апопируватдекарбокенлаза — тиаминпирофосфат прочный и при гель-фильтрации не распадается. Следовательно, жесткое связывание тиаминпирофосфата возможно только в присутствии магния, и наоборот, магний прочно связывается с белком только при наличии в системе кофермента. Другими словами, образование стабильного холоэнзима возможно только при одновременном участии всех трех компонентов.
