Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Удаление метнльной группы из четвертого положения тназолового кольца (4-норТПФ) почти полностью лишает возможности кофермент необратимо связываться с апоферментом. Стабильность холофермеита восстанавливается до ис одной величины, если в б'-иоложенис 4-норТПФ ввести метильную группу (см. табл. 12). Таким образом, 4-СНз-группа тиаминпирофосфата необходима для стабилизации связи кофермент апофермент, причем положения 4- и 6'- в этом смысле эквивалентны: производные с метнльной группой в одном из этих положений имеют одинаковое сродство к апопируватдекар-бокенлазе. Дополнительные данные о функциональных группах тиаминпирофосфата были получены при использовании некоторых других аналогов кофермента с определением величин констант ингибирования. Опыты ставили с тем же ферментом—пируватдекарбоксилазой пивных дрожжей.
Как следует из данных, представленных ниже, Km для тиаминпирофосфата равна 2 3 -10 3 М, что соответствует данным других авторов [229]. При удалении 2'-ме-тильной I руппы (2'-деметил ТПФ) сродство кофермента к пируватдекарбоксилазе уменьшается примерно в 10 раз. Это указывает па участие 2'-метнлыюй группы тиаминпирофосфата в связывании его с апоферментом, которое осуществляется, по-видимому, путем гидрофобного взаимодействия. Подтверждением этому служат опыты, поставленные с 2/-оксиТПФ (IV) и 2'мето-ксиТПФ (А7). Основываясь на величине ингибиторной константы, можно сказать, что первый аналог имеет очень низкое сродство к апоэнзиму. Замена в нем гидроксильной группы на СНз-О-группу (второй аналог) повышает его сродство в пять раз, по-видимому, вследствие взаимодействия гидрофобного участка белка с вновь введенной в аналог метнльной группой.
118
Ниже приведены кинетические константы дчя тпамин-иирофосфата и его аналогов [555].
Ингибиторная
константа,
мкМ
мые производные указанных Соединений
Тиамин
2'-Этилтнамин
2'-н-Бутнлтиамии
2'-Метокситиамии
2'-Деметилтиамин
2'-Окситиамин
4')
7U
220
380
2'-ЭтилТПФ (IX)—единственный аналог, способный выполнять коферментную функцию, связывается с белком в такой же степени, как и нативный кофермент, однако в его присутствии активность составляет лишь 25% активности, наблюдаемой с тиаминпнрофосфатом (аналогичные данные получены и группой японских авторов [379]). Следовательно, для проявления каталитической активности к коферменту предъявляются более жесткие структурные ограничения, чем для его взаимодействия с апоферментом. На это же указывает н отсутствие коэнзим-ных функций у 2'-метоксиТПФ и 2'-н-бутилТПФ (X), хотя сродство их к апонируватдекарбокенлазе лишь незначительно отличается от сродства тиаминпирофосфата к ферменту (см. выше).
Тиохромпирофосфат {VI) является конкурентным по отношению к тиаминпирофосфату ингибитором пируватдекарбоксилазы пекарских дрожжей [554]. Взаимодействие этого аналога с апопируватдекарбоксилазой в присутствии магния сопровождается увеличением интенсивности его флуоресценции и сдвигом максимума эмиссии в коротковолновую область спектра. На рис. 26 показано образование тройного комплекса между тиохромпирофос-фатом, магнием и апоферментом при добавлении магния к смеси апоэизима с тиохромпирофосфатом (кривая 4), а на рис. 27 — то же, но при добавлении аналога к двум другим компонентам (кривая 3). Таким образом, последовательность добавления катиона и тпохромпирофосфа-та к апоферменту роли не играет, а наличие магния является необходимым условием образования тройного комплекса (незначительное увеличение флуоресценции, пабиодасмое в отсутствие добавленного магния (рис. 26,
119
I
I
I
I
1
I
4
80 ВО з\\
ВО Z 1 \ ? ВО ' Z \
to - 1 iff
/А \ 1 3 \ 1
zo - v/f \ \ 110'
! W у / \ • § 1
---Г--j -г--- I 1 1 ¦¦ 1 _ _|-J_
Ш
JOD\,nn
Ш
Ш
K,nM
Рис. 26. Влияние магния на образование комплекса пируватдекар-боксилаза — тиохромпирофосфат [554]
/ — тиохромпирофосфат; 2— апофермент; 3— апофермент + тиохромпирофосфат; 4 — как 3, только затем бил добавлен магний
Рис. 27. Образование тройного комплекса между тиохромпирофос-фатом, магнием и апопируватдекарбоксилазой [554]
/—тиохромпирофосфат + магний; 2 — апопируватдекарбоксилаза + магннй; 3 — как 2, но затем добавлен тиохромпирофосфат; 4 — как 3. но затем добавлен тнаминпнрофоефат
кривая 3), обусловлено наличием катионов в системе в качестве примеси. То же самое относится к пирофос-фатной группе, так как тиохром, если судить по отсутствию изменения флуоресценции, не взаимодействует с апопируватдекарбоксилазой ни в отсутствие магния, ни в том случае, когда металл был добавлен. Добавление тиамннпирофосфата к тройному комплексу снижает интенсивность флуоресценции к исходной величине, характерной для свободного тиохромпирофосфата (см. рис. 27, кривая 4). Это указывает на вытеснение тиохромпирофосфата из комплекса и замещение его коферментом. Как взаимодействие тиохромпирофосфата с апофермен-том, так и вытеснение его коферментом осуществляется во времени, подтверждая тем самым факт низкой скоро-
