Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 40

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 86 >> Следующая

О
60
fZO /ВО Мин
112
Специфику влияния аналогов и фрагментов тиамин-пнрофосфата можно объяснить, исходя из факта взаимодействия кофермента с апоферментом как минимум по трем точкам и представления о двустадийности процесса образования холотранскетолазы. На тгервой стадии осуществляется взаимодействие тиаминпирофосфата с апотранскетолазой при участии конечного фосфатного остатка кофермента. В результате этого образуется легко диссоциирующийся каталитически неактивный промежуточный комплекс транскетолаза ••• тиаминпирофос-фат. На второй стадии осуществляется «квазинеобрати-мое» связывание тиаминпирофосфата с белком при участии других частей молекулы кофермента и образование комплекса транскетолаза — тиаминпирофосфат, характеризующегося каталитической активностью.
Схематически это будет выглядеть так: транскетолаза + тиаминпирофосфат ^ транскетолаза ••• тиаминпиро-фосфат^транскетолаза — тиаминпирофосфат. Согласно этой схеме, при низкой концентрации тиаминпирофосфата скорость образования стабильного каталитически активного комплекса транскетолаза — тиаминпирофосфат из исходных компонентов будет лимитироваться концентрацией промежуточного комплекса транскетолаза ••• ти-амннпирофосфат. С повышением исходного количества кофермента концентрация промежуточного комплекса также будет увеличиваться, в результате чего повысится и скорость образования каталитически активного холофермента, что и имело место в эксперименте [19].
Неорганический фосфат уменьшает концентрацию промежуточного комплекса, по-видимому, за счет конкуренции с тиаминпнрофосфатом за апофермент, благодаря этому скорость образования активного холофермента снижается (рис. 24, кривая 2). В свою очередь тиаминмо-нофосфат и свободный тиамин не влияют на первую стадию процесса, где кофермент взаимодействует с атю-транскетолазой за счет своего конечного фосфатного остатка, однако эти соединения вмешиваются на второй стадии процесса, являясь конкурентными ингибиторами по отношению к тиаминпирофосфату. Поэтому общее количество каталитически активного холофермента в их присутствии уменьшается (сравни рис. 24, кривые 3, 4 и /). В присутствии пирофосфата, который является, так же как и тиаминмонофоефат и свободный тиамин,
113
конкурентным ингибитором траискетолазы и в то же время способен, по аналогии с неорганическим фосфатом, действовать и на первую ста шю процесса реконструкции, снижается и скорость реконструкции каталитически активного холофермеита и образуется его меньше (рис. 24, кривая 5).
Подтверждение двустаднйностн процесса образования холотранскетолазы из апофермента и кофермента было получено методом флуоресценции [289]. Этот метод основан на том, что интенсивность флуоресценции апотранс-кетолазы при 350 нм (возбуждение — при 285 нм) уменьшается в результате присоединения к ней кофермента и образования стабильного каталитически активного хо-лофермента [216]. Это позволяло непосредственно следить за ходом реконструкции холотранскетолазы.
Исходная концентрация тиаминпирофосфата (ТПФ) в опытах была значительно выше исходной концентрации апофермента. При этом условии зависимость концентрации холотранскетолазы (холоТК) от времени t с момента добавчения тиаминпирофосфата в пробу описывается уравнением:
где — [холоТК^ — концентрация холофермеита в момент времени /; [холоТК]* — то же при оо, /г.1фф— эффективная константа скорости псевдопервого порядка. Ее величина зависит от концентрации кофермента и определялась в каждом отдельном случае из графика, выра-
А/, и А/те — изменение интенсивности флуоресценции к моменту времени / и при /-*-со, которое в данном случае отражает соответствующую концентрацию холотранскетолазы.
Оказалось, что зависимость &1фф от исходной концентрации тиаминпирофосфата описывается уравнением:
Это указывает на то, что взаимодействие кофермента
с апотранскетолазой, как и предполагалось, осущест-
_ к
вляется по двустадипной схеме: апоТК + ТПФ^ТК---
[холоТК]/ — [холоТК]оо ¦ (1 —е_*9ФФ',)>
жающсго
от времени t, где
U ГТП/Ы
114
Рис. 25. Зависимость эффективной константы скорости псевдопервого порядка от концентрации тиамин п и рофосфа та (ТПФ) в присутствии кальция, взятого в насыщающей концентрации [289]
k
•••ТПФ—»-ТК—ТПФ, где К — константа диссоциации промежуточного комплекса, а к—мономолекулярная константа скорости второй стадии. Они равны, исходя из данных рис. 25, соответственно 2,5*10_ь М и 0,103 сек-1.
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ ТНАМ1ШППРОФОСФАТА, УЧАСТВУЮЩИЕ В ЕГО СВЯЗЫВАНИИ АПОП! 1РУВАТДЕКАРБОКС11ЛАЗОП
В разделе, где рассматривался механизм действия тиаминовых ферментов, уже указывалось, что взаимодействие субстрата с коферментом происходит по второму углеродному атому тиазолового кольца. Последующее отщепление ацетальдегида, образующегося в процессе нируватдекарбоксилазной реакции, и выделение его в среду осуществляется при участии аминогруппы тиаминпирофосфата.
Для выяснения функциональной значимости других частей молекулы тиаминпирофосфата в проявлении им каталитической функции и во взаимодействии его с апо-пируватчекарбоксилазой был синтезирован целый ряд аналогов кофермента [436, 437, 443—445, 447]. Для их характеристики использовали следующие методы [443, 447].
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed