Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 39

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 86 >> Следующая

Концентрация Изменение оптической плот Степень реконструк
ности при 320 нмхЮ4 ции холотранскето-
апотраис- тиаминпн- без добавле С добавленным
кстолаза. рофосфа ния металла кальцием
М-10* М-10* или магнием
(З Ю-8 М)
1,43 1,15 03 81 78
2,30 5,0 12Я 102 79
4,55 0,83 l‘J2 2(54 73
* Рьссчитаиа, исходя из спо1[<етствующнх величин изменения оыи' <.ской плотности
при 320 нм , измеренных в отсутствие извне добавленных катионов и при их до-
бавленин.
уменьшается, и при достаточно высокой его концентрации скорость реакции становится постоянной с самого начала се измерения (рис. 22).
Причина наблюдаемой картины — медленная скорость взаимодействия кофермента с апотранскетолазой. Для доказательства этого положения мы воспользовались известным для такого рода систем уравнением [388]:
1/т = /С+1 • [S0] +- К+1 ¦ Кт-
И действительно получили линейность графиков зависимости 1/т от [5'0] (рис. 23). Здесь т — время предстацио-нарного состояния, [51Р] — начальная концентрация тиамннпирофосфата, а К+1—константа скорости второго порядка образования комплекса транскетолаза — ти-аминпирофосфат. Болес того, величина константы Ми-хаэлиса для тиамннпирофосфата в присутствии кальция, определенная из графика (рис. 23, б), равна 3 0-10-7 М. Такое же значение было получено и по метоау двойных обратных величин Лайнуивсра-Берка. При этом были использованы экспериментальные данные, полученные в одном случае при измерении ферментативной активности после установления стационарной скорости транске-толазной реакшш, а в другом — при измерении актив-
110
BjlD
[ТПф]/06Г1
Рис. 22 Влияние разной концентрации тиаминпирофосфата на скорость транскетола.шой реакции [20]
о — металл не добавляли; б —добав!ен кальций (2,1-10-* М) Концентрация кофермента (М) / — 1.3-10—4; 2 — 2.6-10-5; 3 — 1,3-10-*; 5—6.5-I0-*;
<— 2.6-10-»; 7— 1.3 I0-*; 8— 5.110-7; 9 — 2.6-10-7; 10— 1.3-10-7
Рис. 23. Длительность фазы начального замедления транскетолазной реакции в зависимости от концентрации тиаминпирофосфата (ТПФ) [20]
а — металл не добавляли; б —добавлен кальций (г.ЫО-’ М) Величину т определяли, как показано иа рис. 22.
мости после предварительной инкубации аиотранскето-лазы с кофакторами.
По наклону прямых на рис. 23 можно определить соответствующие значения константы скорости взаимодействия тиамшширофосфата с апоферментом в присутствии кальция и без него. В первом случае оно оказалось равным 3866 М_,сек_|, а во втором — 529 М^сек-1, т. е. более чем в семь раз ниже. Аналогичная обработка результатов, полученных с магнием, показывает, что в присутствии данного катиона константа скорости взаимодействия тоже повышается, но не столь существенно, как при добавлении кальция [20].
111
Рис. 24. Влияние аналогов и фрагментов тиаминпирофосфата на реконструкцию холотранскетолазы [20]
Концентрация «©фермента -2,6-¦10-‘ М; / — проба без добавок;
2 — неорганический ортофосфат (5* 10—3 М); 3— тиаминмоиофос-
фат (1I0_S М); 4 — тиамин (2-•I0~sM); 5 — неорганический пн-рофосфат (5-10-4 М)
Небольшая скорость взаимодействия тиаминпирофосфата с апотранскетолазой могла быть продемонстрирована и непосредственно в опытах, где апотранскстолазу преинкубировали с низкими концентрациями кофермен-та. Через определенные промежутки времени после начала инкубации отбирали пробы и определяли в них транс-кетолазную активность без добавления кофакторов. Ее величина характеризовала количество холофермента, образовавшееся в процессе преинкубации апотранскетолазы с тиаминпирофосфатом за данный промежуток времени. В соответствии с предположением время образования холофермента было тем больше, чем меньше кофермен-та содержалось в пробе [19].
Своеобразным было влияние аналогов тиаминпирофосфата, а также фрагментов молекулы кофермента — ттирофосфата и фосфата при их добавлении в преинку-бируемую пробу на процесс реконструкции холотранскетолазы из апофермента и тиаминпирофосфата (рис. 24).
В присутствии фосфата скорость реконструкции существенно снижается (кривая 2), хотя в конце концов холофермента образуется столько же, сколько и в контроле (кривая 1), где фосфат не добавляли. В присутствии тиаминмонофосфата (кривая 3) и свободного тиамина (кривая 4) наблюдается обратная картина — время установления равновесия между холотранскетолазой и свободными апотранскетолазой и тиаминпирофосфатом остается неизменным, а общее количество холотранскетолазы уменьшается. При добавлении в пробу неорганического пирофосфата наблюдаются оба эффекта: увеличивается время установления равновесия и уменьшается количество образующегося холофермента.
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed