Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 36

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 86 >> Следующая

Сведения относительно природы металла, входящего в состав тиаминовых ферментов, выделенных в нативном виде, достаточно скудны. Так, в частично очищенных препаратах пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей [179, 180] и, возможно, пируватоксидазы Proleus vulgaris [493] было обнаружено наличие магния. Точные количественные измерения не проводились. Более подробно в этом плане исследовали транскетолазу пекарских дрожжей [285]. В работе использовали высокоочищенный однородный препарат фермента, показывающий максимальную активность и без добавления извне кофакторов. Перед исследованием его пропускали через сефадекс G-50, уравновешенный 1-10-3 М калий-фосфатным буфером (pH
101
6,4) —условие, Tipii котором способность кофермента отщепляться от холотранскетоаазы минимальна. Элюцию осуществляли тем же буфером. Содержание металла в нем было незначительное, тем не менее его учитывали при окончательных расчетах.
Согласно предварительным спектрографическим данным, в ферментном препарате, на одной из последних стадий его очистки, обнаруживаются железо, медь, магний, кальций. Первые два, как показали последующие количественные измерения на атомном абсорбционном спектрофотометре,— в незначительном количестве, которое в процессе дальнейшей очистки фермента сохранялось на том же уровне. В высокоочищенных однородных препаратах транскетолазы их было меньше 0,2 г-атом на моль белка. Магния в неочищенных препаратах было достаточно много, но постепенно его количество уменьшалось и конечное содержание становилось примерно равным содержанию жепеза и меди. Больше всего обнаруживалось кальция, и конечное содержание его в высокоочищенных препаратах холотранскетолазы составляло примерно 2,4 г-атом на мо!ь белка.
Что касается функции кальция как кофактора транскетолазы, а также участия двухвалентных катионов в формировании активного центра пируватдекарбоксилазы дрожжей, то речь об этом not дет в последующих главах.
Глава седьмая
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОФАКТОРОВ С ТИАМИНОВЫМИ ФЕРМЕНТАМИ
взаимодействие кальция
С ТРАИСКЕТОЛАЗОП ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ
В данных исследованиях использовали траискстолазу, содержавшую около 0,3 г-атом кальция и 0,1 г-атом магния на моль белка и не содержавшую тнаминпнрофосфа-та. Апофермент преинкубнровалн с кальцием, а также с кальцием и тиаминпирофосфатом, взятыми в насыщаю щих концентрациях. После прсинкубации пробы пропускали через сефадекс G-50 для удаления свободных кофакторов, затем определяли количественное содержание кальция и тиаминпнрофосфата в ферменте. При преинку-бации транскетолазы с кальцием и тиаминпирофосфатом определяли, кроме того, степень реконструкции холофермента — по активности.
В результате проведенных исследований оказалось [32], что с аиоферментом необратимо или, точнее,— «ква-зинеобратимо» (т. е. не отщепляясь в процессе пропускания через сефадекс) связывается около 1 г-атом кальция на моль белка. Если преинкубацию транскетолазы проводили с тиаминпирофосфатом и кальцием, то последнего в реконструированном холоферменте обнаруживалось 2,3 г-атом на моль белка, т. е. примерно столько же, сколько и в нативном холоферменте, о чем говорилось выше (степень реконструкции холофермента в рассматриваемых опытах была 100%-ная).
Следовательно, второй атом кальция или совсем не взаимодействует с апотранскстолазои, или связывается, но обратимо, а кофермент обеспечивает его необратимое связывание.
Как уже указывалось выше, при хранении холотранс-кетолазы в щелочном растворе сульфата аммония происходит отщепление тиамннпирофосфата. Каталитиче-
103
ская активность ферментных препаратов при этом 'снижается, если ее измерять только с одним тиаминпирофос-фатом. Для проявления максимальной активности требовалось добавить еще и ионы двухвалентных металлов. В таких ферментных препаратах количество кальция снижено примерно наполовину по сравнению с исходным холоферментом [285].
Таким образом, один атом кальция достаточно легко удаляется из транскетолазы после (или одновременно) отщепления кофермепта. Транскетолазная активность, определяемая только -с тиамннпирофосфатом, при этом снижается. Это, очевидно, тот кальций, который не связывается необратимо е апотранскетолазой и обнаруживается только в холоферменте, как в нативном, так и в реконструированном. Второй атом кальция связан с -белком более прочно, и для его удаления требуется длительный диализ против раствора ЭДТА и последующее пропускание через сефадекс. Это, по-видщмому, тот кальций, который необратимо связывается с апоферментом и в отсутствие тиаминпирофосфата.
ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ КАЛЬЦИЯ
Рассмотрим результаты опытов, в которых исследовали влияние кальция, добавленного извне, на каталитическую активность апофермента, измеряемую только с тиамннпирофосфатом [286].
Как видно из данных рис. 21, добавление кальция существенно влияет на транскетолазную реакцию, увеличивая се максимальную скорость и сродство кофермента к апоферменту. Последний эффект выражен резче — величина константы Михаэлнса уменьшается от 3,3-10-э М в отсутствие металла до 4,0 - 10_в М в присутствии 5,0*
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed