Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
98
E/mz t,Z
0,}
J 7 ff J 7 S J 7 S J 7 S J 7 pH
Рис. 20. Положение оптимума pH транскетолазнон реакции в запи-снмостн от природы и концентрации двухвалентных катионов [28]
Концентрация катионов (в М): а — магний: /—4.2-10-*, 2 — 2,5-10-*, 3-8.2-•10“»; б—марганец: /— 1,5-10-\ 2-4,2-10-*; 3-8,3-10-*; в — кальций:
/ — 3.3-10-4. 2— 1,0-10-». 3-10-10-'; г —цинк: / — 2.0-10-4; 2— 1.0-10-»; 3-5.0-¦10-*; д—никель: / — 5.0-10-*. 2 — 5.0-10-4. 3-5.0-10-*
проявлялось и с другими исследованными катионами (см. рис. 20).
Одна и та же величина -сдвига оптимума pH при сильно различающемся диапазоне концентраций различных катионов, и наоборот (сравни, например, опыты с хлористым магнием и хлористым марганцем на рис. 20), указывает на то, что влияние катионов специфическое и не связано с изменением ионной силы реакционной смеси или концентрации анионов хлора. Это же подтвердили и специальные опыты, в которых хлористый калий добавляли в среду в разной концентрации, что совершенно не сказывалось на положении оптимума pH транске-толазной реакции [28].
Для проявления максимальной активности и других тиаминовых ферментов, лишенных тиаминпирофосфата, также требовалось в большинстве случаев, кроме кофермента, добавлять ионы двухвалентных металлов [79, 193, 209, 225, 269, 324, 396]. Обычно это был магний, но и многие другие двухвалентные катионы обладали активирующей способностью. Их действие сильно различалось как
о----/
*----Z
•-—J
0,8 /\ 0,8 х >клкд
99
4*
по величине абсолютного эффекта, так н пи способности активировать различные ферменты Так, пируватдегидро-геназный комплекс из сердца свиньи сильнее активировался кальцием, чем магнием. По степени активирующего действия на пируватдекарбоксилазу пекарских дрожжей металлы располагались в следующий ряд: Мg2+> >Mn2+>Co2+>Cd2+>Zn2+>Ca2+>Fe2+ [180]. То же для других ферментов: пируватоксидаза из Proteus vulgaris: Mn2+>Mg2+>Fe3+, Ni2+>Zn2+>Co2+ (Ca2+ и Cd2+ были неактивны) [493]; оксоглутаратдекарбоксилаза из Mycobacterium phlei: Mn2+>Mg2+ (Ca2+ неактивен, Zn2+ — ингибитор) [557]; ацетолактатсинтетаза из Serratia marces-cens: Mnz+ >Сa2+ >Mg2+ >Co2+ >Ni2+ >Вa2+ >Zn2+ [339]; пируватдекарбоксилаза из зародышей пшеницы: Mg2+, Coz+, Zn2+>Fe2+>Mn2+>Ni2+>Cd2+(Ba2+, Ca2+ и Sr2+ — неактивны) [478].
Фенилпируватдекарбоксилазу из Achromobacter eury dice активирует только магний. Марганец, кобальт, никель никакого влияния на активность практически не оказывают, но будучи добавлены в систему вместе с магнием (в эквимолярных концентрациях) мешают проявить ему свое активирующее действие; цинк сам по себе ингибирует фермент [78J.
Разобщение фермента от тиаминпирофосфата обычно сопровождается отщеплением металла, однако металл связан с белком более прочно, и в ряде случаев требуется дополнительное воздействие для его удаления из фермента [182, 205, 396, 493].
В настоящее время трудно сказать, является ли металл обязательным компонентом для действия тиаминовых ферментов или его роль ограничивается активацией. Возможно, справедливо и то, и другое, и в каждом отдельном случае характер влияния металла определяется спецификой фермента и реакции, которую он катализирует. В литературе имеются примеры, подтверждающие обе эти возможности. Так, фосфокетолаза Acetobacter xylinum, пируватдегидрогеназный комплекс сердца свиньи и ацетолактатсинтетаза из Serratia marcescens после соответствующей обработки теряют способность активироваться тиаминпирофосфатом в отсутствие добавленных катионов двухвалентных металлов [182, 339, 451]. С другой стороны, не исключается возможность
100
частичного проявления активности некоторых ферментов и в отсутствие металлов [361, 478].
Для интерпретации опытов с транскетолазой печени крыс, в которых показано полное восстановление активности разобщенного фермента при добавлении только кофермента [250], необходимы дополнительные, более подробные исследования. В частности — количественное определение возможного присутствия жестко связанного металла в самом белке или свободных катионов в качестве примеси в других компонентах системы. Впрочем, это же относится и ко всем остальным экспериментам, о которых говорилось выше.
Степень реактивации разобщенной транскетолазы пекарских дрожжей последующим добавлением кофакторов зависела от порядка их добавления [134]. Максимальная активность наблюдалась только в том случае, если кофакторы добавляли вместе или тиаминпирофос-фат добавляли после магния. С одним тиаминпирофосфа-том активность была снижена примерно наполовину, и она не повышалась при последующем добавлении металла. Кофермент, связываясь с апоферментом в отсутствие металла, не только не проявляет каталитическую активность, но мешает связаться магнию и проявить свое активирующее действие. На основании этих данных авторы полагают, что металл в транскетолазе выполняет функцию мостика между апоферментом и тиаминпирофосфа-юм. Аналогичные предположения высказывались и ранее, при изучении других тиаминовых ферментов [180, 493], хотя убедительных экспериментальных данных в пользу этого не приводилось.
