Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
(NH4)2S04 1,3 100 48 30 25 10 5 0
(NH4)2S04 l,:n 100 50 30 25 10 0 ---
nh4ci 2,6 100 50 20 15 5 0 ---
nh4ci 4,0 100 2) 6 0 --- --- ---
U2S04 1,3 100 80 80 ---- - ---' --
аммоний) наблюдается полное отщепление тиаминпирофосфата. Примерно одинакова и скорость процесса отщепления. Если концентрация ионов аммония увеличивается (4 М хлористый аммоний), то и скорость процесса повышается.
Таким образом, для отщепления тиаминпирофосфата от холотранскетолазы оптимальными являются следующие условия [18]: концентрация сульфата аммония в среде—1,33 М (при более высокой — фермент может частично выпадать в осадок); концентрация белка—1 мг/мл (при более низкой — фермент менее стабилен и не полностью выпадает в осадок при последующем высаливании сульфатом аммония для хранения и использования в работе); pH—8,5 (при более высоких значениях pH фермент менее стабилен).
Возможно, причиной того, что, используя методы Ре-кера и сотр. (переосаждение сульфатом аммония и диализ против раствора сульфата аммония), полного отщепления тиаминпирофосфата не удавалось получить, являлась высокая концентрация белка в растворе фермента (авторы этот пункт в своих методиках никак не оговаривают). Интересно заметить, что в лаборатории Томи-та, где работают с транскетолазой пивных дрожжей, выделяемой по той же методике, что и транскетолазу пекарских дрожжей, также теперь не пользуются дая
93
отщепления тиаминпнрофосфата методиками Рекера и сотр., а используют способ [378], в принципе аналогичный предложенному нами.
К вопросу о влиянии ионов аммония на процесс отщепления кофермента мы еще вернемся при дальнейшем изложении.
СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ТИАМИНПИРОФОСФАТА Стабилизация транскетолазы пекарских дрожжей
В условиях тепловой денатурации. Выдерживание апотраискетолазы в растворе трис-буфера, pH 7,6, при 45° сопровождалось ясно выраженным снижением ферментативной активности: примерно на 50% —после часа инкубации и более чем на 60% —через два часа инкубации. При добавлении в инкубируемые пробы тиаминпи-рофосфата степень инактивации фермента заметно снижалась. Ощутимый эффект наблюдался уже при концентрации кофермента, равной 1,6-10-5 М. Он усиливался при повышении содержания тиамннпирофосфата в пробе, и при его концентрации 4-10-4 М (это та концентрация кофермента, которая при изменении транскетолазной активности является насыщающей) ферментативная активность сохранялась практически неизменной, лишь незначительно снижаясь ко второму часу инкубации [2]\
В условиях кислотной денатурации. Как следует из данных, представленных в табл. 9, в условиях кислотной денатурации (инкубация фермента при pH 4,4 и комнатной температуре) происходит резкое снижение транскетолазной активности апофермента — через 15 мин остается лишь около 40% исходной ее величины. Холофер-мент при этих же условиях и за это же время выдерживания инактивируется менее чем на 10%. Активность апо- и холотранскетолазы в контроле — инкубация при pH 7,6 — сохраняется на исходном уровне.
Судя по оптическим свойствам, изученным в далекой ультрафиолетовой области спектра, общая исходная (до кислотной денатурации) структура апо- и холофермента
1 Стабилизирующий эффект тиамннпирофосфата наблюдали и при тепловой инактивации декарбоксилазного компонента оксоглута-ратдегидрогеназного комплекса из мозга быка [59].
94
Таблица 9
Стабильность транскетолазы в условиях кислотной денатурации (_']
Выдерживание транскетолазы (2,6-10~6М) в 5-10~2М ацетатном буфере, pH 4,4, при комнатной температуре
Время выдерживания, мин
Степень инактивации*, % от исходной активности**
апофермент
холофермент
ЯГ» г»
8 47 8
15 58 9
* Активность в контроле (выдерживание япо- и холотранскетолазы в 5-10-* М трис-буфере, pH 7,6) оставалась исизменноЛ в течение всего времени проведения эксперимента.
** Величину ферментативной активности во всех случаях определяли при pH 7,6 в присутствии кофакторов, взятых в насыщающих концентрациях.
одинакова — кривые дисперсии оптического вращения и циркулярного дихроизма в обоих случаях по существу идентичны. Другими словами, не было найдено различий в содержании упорядоченных структур. Различия, однако, появлялись при кислотной денатурации. Выражалось это в следующем.
В исходном состоянии (pH близкий к нейтральному) оптическое вращение во впадине кривой дисперсии оптического вращения ([ш'Ы и для апо~ и для холотранскетолазы было одинаковым и составляло величину порядка —4000°. В результате кислотной денатурации (через 15 мин выдерживания при pH 4,4 — при этих условиях активность апотранскетолазы снижалась примерно на 60%—см. табл. 9) оно изменялось в значительно большей степени в случае апофермента по сравнению с хо-лоферментом — соответственно до —3300° и —3700°. Существенно, что при последующей ренатурапии оптическое вращение апофермента продолжало изменяться в том же направлении, а кривая дисперсии оптического вращения холофермента приобретала вид, близкий к первоначальному (до денатурации). Следовательно, в холо-транскетолазе по сравнению с апотранскетолазой изменения общей структуры белковой молекулы при кислотной денатурации выражены, во-первых, в меньшей степени я, во-вторых, указанные изменения практически полностью обратимы.
