Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 32

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 86 >> Следующая

90
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПРОЧНОСТЬ СВЯЗИ ТИАМИНПИРОФОСФАТА С ТРАНСКЕТОЛАЗОИ
С апотранскетолазой пекарских дрожжей кофермент связан относительно непрочно и частично отщепляется от нее уже в процессе выделения и очистки фермента. При хранении препаратов траискетолазы в виде суспензии кристаллов в растворе сульфата аммония 50%-ной степени насыщения наблюдается дальнейшее высвобождение тиаминпирофосфата. Процесс этот, однако, медленный, и для перехода всего количества холофермента в апоФермент обычно требуется длительное время.
Для принудительного отщепления тиаминпирофосфата от холотранскетопазы пекарских дрожжей в лаборатории Рекара были разработаны три метода: переосажде-пие ферментного препарата из щелочного раствора сульфата аммония; 20-часовой диализ против 1000 кратного объема 0,6%-ного раствора ЭДТА в 2-10—* М калий-фос-фатном буфере, pH 7,4, с последующим 20-часовым диализом против того же объема ЭДТА, но приготовленного на 0 9%-ном хлористом калии [396] и 48-часовой чиализ против 1,6 М раствора сульфата аммония, pH 7,8 [1341.
Оказалось, однако, что эффективен только второй способ — диализ против раствора ЭДТА. При переосаж-дении из щелочного раствора сульфата аммония кофермент также отщепляется, но даже посчо 4—5 пепеосаж-дений в препаратах еще оставалось до 20% холофермента. Кроме того, происходило значительное снижение ферментативной активности (имеется в виду общая активность, определяемая в оптимальных условиях при насыщающей концентрации кофакторов) [18].
По существу аналогичные результаты были получены и при диализе против щелочного раствора сульфата аммония — неполное отщепление тиаминпирофосфата и потеря ферментативной активности. Как оказалось впоследствии, диализ сам по себе ничего не дает и его замена простым выдерживанием при той же концентрации сульфата аммония приводит к аналогичной степени отщепления кофермента, причем каталитическая активность ферментных препаратов сохранялась на исходном уровне [18].
Выдерживание препаратов траискетолазы в 1,6 М растворе сульфата аммония, pH 7,8, в течение 48 ч при
91
концентрации белка 10 мг/мл сопровождалось частичным отщеплением кофермента. При тех же условиях, но при pH 8 5, оно уже было полным. Снижение исходной концентрации белка в два раза сопровождалось полным отщеплением тиаминпирофосфата и при pH 7,8. При концентрации 1 мг/мл полный переход холофермента в апо-фермент осуществлялся уже за 24 ч. При pH б 8 кофермент практически не отщеплялся и изменение концентрации ферментного препарата в исследуемых пробах существенно не влияло на результаты опыта [18].
Степень и скорость отщепления кофермента находятся в прямой зависимости от концентрации раствора сульфата аммония, в котором проводили выдерживание транскетолазы При его концентрации, равной 1,33 М, уже через 5 ч холотранскетолаза в препаратах не обнаруживалась. В растворах сульфата аммония с более низкой концентрацией снижались как скорость, так и степень отщепления тиаминпирофосфата. Более того, полного перехода холотранскетолазы в апотранскетолазу не удавалось наблюдать ни при одной из исследованных концентраций сульфата аммония ниже 1,30 М (табл. 8).
Ранее было известно ингибирующее действие ионов сульфата на транскетолазную активность [134]. Можно было поэтому предполагать о наличии конкурентных взаимоотношений между коферментом и указанными анионами и в этом видеть причину влияния сульфата аммония на процесс отщепления тиаминпирофосфата от' холотранскетолазы.
Последнее, однако, не подтвердилось в эксперименте: в 1,3 М растворе сернокислого аммония кофермент отщеплялся быстро и полностью, а в 1 3 М растворе сернокислого лития — медленно и далеко не полностью (см. табл. 8), несмотря на то, что концентрация сульфатных ионов в обоих случаях была одинакова. Из этих же опытов следует, что и величина ионной силы существенного влияния на отщепление кофермента не оказывает (в приведенных опытах — резко различных по результатам — она была одинакова).
Оставалось предположить специфическое влияние ионов аммония, входящих в состав (NHi^SO*. Это становится очевидным, если опять обратиться к результатам, приведенным в табч. 8. При одной и той же концентрации ионов аммония (1,3 М сульфт аммония и 2,6 М хлористый
92
Таблица 8
Отщепление тиаминпирофосфата от транскетолазы при ее выдерживании в ра творах различных солей [/5] (концентрация белка — 1 мг/мл\ pH 8,5)
Соль Концен Содержание холотранскетолазы, % от исходного
0 ч 1 ч 2 ч 3 ч 4 ч 5 ч 6 ч

(NH4)2S04 ** 100 90 80 80 80 80 __
1
©
00
(NHj)2SO., 3,5-Ю'1 100 80 G0 50 50 50 ---¦
(NH4),S04 7,0-10-» 100 50 30 .10 30 30 ---
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed