Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 13

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 7 8 9 10 11 12 < 13 > 14 15 16 17 18 19 .. 86 >> Следующая

Согласно двуцентровому механизму, предложенному Шелленбергером н сотр. для пируватдекарбоксилазы,
36
который мы только что рассматривали, освобождение продукта реакции происходит при непосредственном участии аминогруппы тиаминпирофосфата, выполняющей роль промежуточного акцептора остатка ацетальдегида. Роль этой группы в реакции окислительного декарбоксилирования пирувата была недавно исследована в лаборатории С. Е. Северина [53]. В качестве ферментного препарата использовали пируватдегидрогеназ-ный комплекс, выделенный из грудной мышцы голубя, и пируватдекарбоксилазный компонент этого комплекса (с использованием в качестве искусственного окислителя 2,6-дихлорфенолиндофенола), а в качестве аналогов кофермента — моно- и диметилированные по 4'-аминогруппе производные тиаминпирофосфата, а также окситиаминпирофосфат {II).
Оказалось, что ни пируватдегидрогеназный комплекс, ни его пируватдекарбоксилазный компонент не проявляют каталитической активности, если вместо тиаминпирофосфата использовали вышеуказанные ана-поги. В то же время, если судить по кинетическим данным, аналоги связываются с белком, причем связывание ос\ществляется по месту активного центра.
Более того, при использовании соответствующим образом меченного по углероду пирувата не удалось показать наличия и первого акта реакции превращения субстрата, т. е. отщепления С02 и образования окси-этильного производного окситиаминпирофосфата, как это было ранее показано Шеллснбергером и сотр. для пируватдекарбоксилазы.
Таким образом, модифицированные по 4'-амино-группе аналоги тиаминпирофосфата не способны заменить нативный кофермент в реакции окислительного декарбоксилирования пирувата ни на одной из стадий ее протекания.
Глава третья ИНГИБИТОРЫ
Различные ингибиторы давно и успешно используются для изучения ферментов, их структуры, функциональных групп, строения активного центра, механизма действия, специфики взаимодействия с субстратами и коферментами. Особенно много полезной информации было получено при работе с тканевыми экстрактами и с частично очищенными ферментными препаратами, когда другие методы оказались, по существу, не эффективны. Но и сейчас, когда стало возможным выделить ферменты в чистом виде в количествах, достаточных для их изучения другими методами, ингибиторный анализ не утратил своего значения и продолжает широко использоваться в различных лабораториях. Тем более, что препаративный синтез высокоспецнфических ингибиторов позволяет осуществлять целенаправленное воздействие на фермент и вмешательство в обменные процессы живой клетки или даже целого организма.
Тиаминовые ферменты в этом смысле изучены еще недостаточно. Одним из наиболее широко изученных ингибиторов тиаминовых ферментов является окси-тиамннннрофосфат (//). В опытах in vivo интенсивно исследовали дефосфорнлированную форму этого аналога—окентиамнн, которая легко проникает в клетки (исключение составляет ткань мозга [36, 38]) и характеризуется высокой степенью эффективности [36, 38, 62, 185, 180]. Следует, однако, заметить, что действие оксн-тиамнна in vivo обусловлено его влиянием не только на активность тиаминовых ферментов, но и на целый ряд других обменных реакций — факт, убедительно показанный в лаборатории Ю. М. Островского [40].
38
ИНГИБИРОВАНИЕ ТИАМИНОВЫХ ФЕРМЕНТОВ ОКСИТИЛМИНПИРОФОСФЛТОМ
Результаты экспериментов, поставленных с высоко-очищеппым препаратом пнруватдекарбоксплазы, выделенным из зародышей пшеницы, приведены на рис. 1. Концентрация кофермента и окситиамннпирофосфата во всех случаях была соответственно 7,8-10 9 М и 3,88-10~7 М. Фермент был практически полностью разобщен от тиаминпирофосфата и в его отсутствие показывал лишь незначительную ферментативную активность. После добавления кофермента активность восстанавливалась, причем вначале скорость реакции была значительно снижена, потом она увеличивалась и со временем достигала постоянной величины (кривая /). Это, по видимому, можно объяснить медленной скоростью взаимодействия аиофермента с коферментом, так как в случае предварительной инкубации апопиру-ватдекарбоксилазы с тнаминнирофосфатом постоянная скорость реакции наблюдается в более ранние сроки (кривая 2). Последующее добавление в эту пробу оксн-тнамннпирофосфата не влияет на величину ферментативной активности (кривая 3), показывая тем самым отсутствие ингибирования холофермента и достаточно прочное связывание кофермента с апопируватдекарбо-ксилазой. Одновременное добавление к энзиму тиамии-пнрофосфата и окситиамннпирофосфата уже существенно влияет на его активность (кривая 4), и оно еще более усиливается, когда сначала добавляется ингибитор, а затем кофермент (кривая 5). Если в последнем случае концентрацию тиаминпирофосфата повысить примерно в 25 раз (в таком случае она становится сопоставимой с концентрацией окситиамннпирофосфата), то определяемая активность станет выше (кривая 6). Таким образом, кофермент достаточно легко вытесняет ингибитор нз его связи с белком.
Похожая картина наблюдалась и при исследовании пнруватдекарбоксплазы, изолированной из пивных дрожжей [152].
Предыдущая << 1 .. 7 8 9 10 11 12 < 13 > 14 15 16 17 18 19 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed