Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
27
к тиаминпнрофосфату. Тиазоловая половина „активного гликольальдегида" имеет структуру тиоимида глицериновой кислоты. Отсюда следовало, что если “С-диокси-этильная группа присоединена ко второму углеродному атому тиазолового кольца, то при обработке 14С-диокси-этилтиаминпирофосфата гидроксиламином должна образовываться радиоактивная глицерил-гидроксамовая кислота:
Так и оказалось в действительности. Эти данные указывали на то, что “С-1,2-диоксиэтильная группа присоединена во втором положении тиазолового кольца тиаминпирофосфата и, следовательно, «активный гли-кольальдегид», как и предполагалось, является 3-(2-метил-4-амино-5-пиримидил) - метил-2- (1,2-дноксиэтил) -4-метил-5- (пнрофосфорил-2-оксиэтил) -тиазолом.
Оксиэтилтиаминпирофосфат был изолирован нз инкубационной среды, содержавшей пируват и один из следующих ферментов: пируватдекарбоксилазу зародышей пшеницы, пируватдегидрогеназный комплекс или пируватдекарбоксилазу из пивных дрожжей [115, 116, 229, 230, 232, 460]. Было также показано, что изолированный оксиэтилтиаминпирофосфат участвует во всех энзиматических реакциях, субстратом которых является
В процессе образования «активного ацетальдегида» в инкубационной среде накапливаются и другие производные тиаминпирофосфата. Так, из 1-14С-пирувата в присутствии пируватдекарбоксилазы образовывалось меченое производное тиаминпирофосфата, которое затем декарбоксилировалось с выделением меченого С02 [229, 230, 232]. Если же в качестве субстрата исполь-
NH.OH
н,о
Н
XN-----С /
'€ + I
xNHOH Н
HS
пируват [171, 172, 229, 232, 235, 238, 508].
28
зовали 2 14С пируват, то меченым оказывался ацетальдегид. Кроме того, указанное производное кофермента могло превращаться в оксиэтилтиаминпирофосфат как под влиянием пируватдекарбоксилазы, так и спонтанно. Аналогичные результаты были получены при замене пируватдекарбоксилазы пируватдегидрогеназным комплексом. На основании этих данных авторы высказывают предположение, что вещество, образующееся, наряду с оксиэтилтиаминпирофосфатом, из пирувата и тиаминпирофосфата при наличии соответствующего фермента, является «активным пируватом», т. е. пируватом, соединенным с тиаминпирофосфатом, и участвует в реакции в качестве предшественника оксиэтилтиаминпирофосфата. Накопление промежуточного кофермент-субстратно! о комплекса наблюдалось и в реакциях, катализируемых транскетолазой [135]. Образование «активного кофер-мент-субстратного комплекса», по-видимому, характерно для всех тиаминовых ферментов.
На основании изложенного материала представляется возможным изобразить следующую последовательность отдельных этапов в реакциях, катализируемых тиаминпирофосфатом. На первой стадии субстрат взаимодействует с коферментом, присоединяясь ко второму углеродному атому тиазолового кольца; образуется так называемый «активный субстрат». Затем происходит разрыв —С—С-связи субстрата и образование соответствующего «активного альдегида». Характер же дальнейших превращений будет зависеть от условий и специфики фермента, катализирующего данную реакцию. «Активный гликольальдегид» переносится на соответствующий акцептор альдегида, а «активный ацетальдегид» (или какой-либо другой, в зависимости от того, какая а-кетокислота вступила в реакцию) будет или освобождаться в свободном виде, или окисляться и претерпевать дальнейшие превращения, или участвовать в ацилоиновой конденсации.
Таким образом, в качестве первичного продукта декарбоксилирования предполагался «активный альдегид», например, оксиэтилтиаминпирофосфат (XIV), если субстратом реакции служила пировиноградная кислота. Действительно, как уже говорилось выше, оксиэтилтиаминпирофосфат, полученный синтетически н ферментативно, подвергался тем же энзиматическим превраще-
29
ниям, что и пируват. И хотя скорость его превращения была на несколько порядков ниже, чем пирувата, однако это объясняли медленным замещением кофермента, связанного с апоферментом оксиэтилтиаминпирофосфа-том [31, 171, 173, 228, 313]. Экспериментальные данные как будто подтверждали такое объяснение. Впоследствии, однако, оказалось, что это не совсем так. Действительно, как отщепление тиаминпирофосфата, так и взаимодействие оксиэтилтиаминпирофосфата с апоферментом осуществляется медленно, однако даже при использовании субстратных количеств апопируватдекар-боксилазы в условиях ее полного насыщения оксиэтил-тиаминпирофосфатом скорость образования ацетальдегида оказывалась на несколько порядов ниже по сравнению с опытами, где использовали исходный субстрат реакции — пировиноградную кислоту [173, 513].
Было высказано предположение, что лпмитнрующен стадиен при энзиматическом превращении оксиэтнл-тиаминпирофосфата является отщепление от него протона с образованием а-карбаниона (XVIII). В пользу
этого свидетельствовали и данные, полученные методом ЯМР [355, 514]. Сущность их заключается в том, что переход протонированной формы оксиэтилтиаминпиро-
