Биогенный магнетит и магниторецепция. Новое о биомагнетизме. Том 1 - Киршвинк Дж.
ISBN 5-03-001274-5
Скачать (прямая ссылка):
2.2. Электронная микроскопия
2.2.1. Общие методы
Детальное описание железосодержащих тканей получают в ультра-структурных исследованиях, которые позволяют классифицировать железосодержащие клетки и выявлять внутриклеточную локализацию железа. Во всех случаях данные электронной микроскопии должны коррелировать с данными световой микроскопии. Имея это в виду, мы окрашивали срезы фиксированных и заключенных в среду для электронной микроскопии тканей (толщиной 1 мкм) ферроцианидным методом, а затем тонкие (800 А) срезы исследовали с помощью электронного микроскопа.
Общим методом подготовки ткани для электронной микроскопии является ее фиксация 2,5%-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4, в течение 1 ч при комнатной температуре. В некоторых случаях, например у голубей, первичную фиксацию осуществляют путем перфузии фиксатором всего животного. В других случаях, например у пчел, ткань выделяют препарированием и фиксируют погружением в среду. После первичной фиксации ткань извлекают из организма, промывают в буфере в течение 30 мин, а затем дополнительно фиксируют в 1%-ном растворе четырехоксида осмия в фосфатном буфере в течение 1 ч. При аналитической электронной микроскопии обработку осмием не производят. Ткань обезвоживают проволкой через ацетон и заключают в пластмассу «Polybed» (Polysciences) или эпон 812. Эпон более предпочтителен для аналитической микроскопии, но он малодоступен в настоящее время. Для обычной микроскопии пригодны любые пластмассы, имеющиеся в продаже.
Толстые или тонкие срезы делают на ультрамикротоме, используя стеклянные или алмазные ножи. Если ткань особенно богата гранулами железа, предпочтительнее алмазный нож, поскольку стеклянный быстро тупится. Срезы помещают на плоские медные сетки, окрашивают в течение 20-30 мин насыщенным водным раствором уранилацетата, промывают, а затем окрашивают в течение 1 мин цитратом свинца по Рейнольдсу. Использование солей тяжелых металлов (четырехоксида осмия, уранилацетата и цитрата свинца) необходимо для выявления клеточных деталей. Для аналитической микроскопии делают более толстые (1500 А) срезы не обработанного осмием материала, заключенного в эпон. Некоторые срезы затем контрастируют ураном и свинцом для выявления структуры клеток, но остальные, предназначенные для анализа, не окрашивают вообще.
При наблюдении в электронный микроскоп на обычных тонких срезах хорошо видна структура клетки. Если присутствует железо, его (по крайней мере, в тех тканях, которые мы изучали) можно выявить в виде электроноплотных частиц или отложений. Часто бывает трудно отличить эти отложения от другого интенсивно окрашенного материала.
Следует отметить, что гранулы железа часто дробят и разрывают срез в процессе его изготовления. К тому же железо обычно является наиболее электроноплотным объектом в срезе. Однако на основе одних ультра-структурных исследований нельзя провести надежную идентификацию материала. Полезно сравнивать ультраструктурные изображения с картинами окрашивания, наблюдаемыми на срезах того же материала толщиной 1 мкм в световом микроскопе.
Заливочные пластмассы, необходимые для электронной микроскопии, значительно тверже, чем гликол-метакрилатные пластмассы, используемые для световой микроскопии. Поэтому окрашивание эле-ктронно-микроскопических срезов толщиной 1 мкм связано с трудностями, обусловленными плохим проникновением красителя. Срезы делают на ультрамикротоме, на плаву наносят на предметные стекла, высушивают и обжигают, подогревая стекла в течение приблизительно 30 с на пламени спиртовки. Стекла погружают на 15 мин в горячий красящий раствор, промывают дистиллированной водой, а затем дополнительно окрашивают. Этот процесс иожно повторять многократно, пока не достигается удовлетворительная интенсивность окраски. Обычно для этого достаточно двух окрашиваний. В случае необходимости срезы можно обработать красителем Кернехтрота. В результате на срезе виден голубой осадок.
Важно исследовать ряд срезов для того, чтобы убедиться в устойчивости картины окрашивания и в том, что она не связана с загрязнением среза. При подготовке срезов для электронной микроскопии окраска всегда менее интенсивна, чем в других случаях из-за очень тонких срезов и относительной жесткости пластмассы. Тем не менее на срезе можно ясно видеть отложения железа и идентифицировать клетки, содержащие железо. Сориентировав соответствующим образом блок с клетками, можно сделать тонкие срезы для электронной микроскопии. При малом увеличении электронного микроскопа сравнивают клетки, имеющие электроноплотньте частицы, с клетками, дающими позитивное окрашивание на железо в световом микроскопе. Это весьма существенно, поскольку не все плотные частицы, видимые в электронный микроскоп, действительно содержат железо.
2.2.2. Аналитическая электронная микроскопия
Чтобы однозначно установить, что электроноплотные частицы содержат железо, необходим рентгеновский микроанализ. Как отмечалось выше, для этого срезы должны быть толще, чем обычные срезы для электронной микроскопии, и их не следует обрабатывать осмием, свинцом или ураном. Срезы можно помещать на стандартные медные сетки, хотя предпочтительнее сетки из углерода. Перед исследованием срезы должны быть покрыты спектрально-чистым углеродом. Углерод
