Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 46

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 122 >> Следующая

прнмеся'ми негидролизованного IgG (в основном IgG2).
7. Удаляют Fab-фрагменты, нанося второй пик на колонку с протеин А-
сефарозой CL-4B, которая связывает Fc-фрагменты и все интактные молекулы
IgG, кроме IgG3, но пропускает Fab-фрагменты. Элюируют Fc-фрагменты и IgG
с помощью 3 М KCNS и диализуют собранную фракцию против PBS.
8. В заключение отделяют IgG от Fc-фрагментов на колонке с сефадексом
G200 в PBS. IgG выходит в первом пике, а чистые Fc-фрагменты- во втором.
Посколь'ку Fc-фрагменты перемещаются к аноду, в ходе двумерного ИЭФ в
агарозе они будут смещаться и формировать отдельный пик преципитации.
Этот пик может быть вырезан и использован как источник очищенного
иммуногена (Fc-фрагментов).
11. Контроль качества антител
Для получения достоверных данных с минимальными рас-' хождениями между
лабораториями применяют различные способы стандартизации и обычно уделяют
основное внимание использованию стандартного антигена. Однако качество
антисывороток тоже играет важную роль и на него следует обращать внимание
в первую очередь. Это относится как к сывороткам, полученным самим
исследователем, так и к коммерческим. Ни производитель, ни поставщик
сыворотки не в состоянии проверить весь набор антител различной
Специфичности на предмет их пригодности для всевозможных исследований в
конкретных условиях каждой лаборатории. Поэтому свойства того или иного
реагента необходимо проверить непосредственно перед использованием.
112
Глава 2
11.1. Рекомендации
1. Применяют стандартный антиген для тестирования сывороток. В
зависимости от предполагаемого использования сыворотки это может быть
очищенное вещество в растворе, смесь разных антигенов, микроорганизмы,
клетки, ткани и т. д.
2. При возможности всегда используют контрольную антисыворотку (см. рис.
2.8. и 2.10).
3. ВсеГда включают в систему контроля те методы исследования, для
осуществления которых предназначается антисыворотка.
4. Каждую пробу крови от каждого животного исследуют отдельно и смешивают
только вполне подходящие сыворотки.
11.2. Последовательность контрольных исследований
1. Проверяют специфичность, определяют, какая необходима абсорбция. После
проведения необходимых мероприятий повторяют тестирование (см. табл.
2.5).
2. Определяют титр антител. Концентрированную IgG-фракцию можно добавить
к сыворотке для увеличения отношения антитела: общий белок.
Альтернативный путь - приготовить цельную сыворотку как фракцию IgG
необходимой концентрации. Преимущество такого подхода заключается в еще
большем увеличении отношения антитела: белок при уменьшении количества
добавляемого белка в системе и уменьшении фона. Это также позволяет
стандартизовать концентрацию антител в последовательно приготавливаемых
сериях антител одной и той же специфичности. Целесообразно иметь в запасе
некоторое количество антител в концентрации выше требуемой для
"улучшения" сывороток. Антисыворотка, предназначенная для реакции
преципитации, должна содержать не менее 1-2 мг специфических антител в 1
мл, а еще лучше- 5-10 мг/мл для уменьшения количества добавляемого белка.
Необходимо проверить чистоту IgG-фракции полученных антител, и если она
удовлетворительна, то определить общий белок по оптической плотности и
установить отношение антитела: общий IgG.
3. Определяют авидность. Высокая авидность необходима для проведения
радиоиммунологического анализа в жидкой фазе, а также для методов, где
важно иметь низкий фон, в том числе для осуществления
иммуногистохимических исследований клеток и тканей и Вестерн-блоттинга.
Отличительное свойство антител с высокой авидностью заключается в том,
что они сохраняют способность оптимально связываться с ан-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
113;
тигеном в высоких разведениях, а затем эта способность быстро падает до
отрицательных значений при избытке антигена. Это свойство легко выявить,
определяя угол наклона кривой связывания антисыворотки в различных
концентрациях с одним и тем же количеством антигена. Сохранение
оптимального связывания по мере разведения, за которым наступает резкое
его падение, служит доказательством высокой авидно-сти. Наклон можно
определить как процент падения связывания (т. е. оптической плотности в
ИФА, радиоактивности осадка в РИА и т. д.) при каждом последующем
разведении в диапазоне линейной зависимости. Четко очерченные кольца и
линии преципитации в геле тоже свидетельствуют о высокой авидности
поликлональной антисыворотки.
Методы, позволяющие измерить образование иммунных комплексов в растворе,
например нефелометрия, также дают возможность определить а'видность
сывороток. Высокоавид-ные сыворотки быстро образуют стабильные иммунные
комплексы. Лишь небольшая часть сывороток, полученных от животных, имеет
идеальные нефелометрические свойства.
4. Аффинность может быть определена только для антител к гаптенам с
помощью равновесного диализа [51].
5. Изотип: хотя у кроликов и овец при иммунизации с применением ПАФ
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed