Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 45

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 122 >> Следующая

109
ние еще меньше. При необходимости IgG3 может быть удалей адсорбцией иа
сефарозе в следующем порядке:
5. 10 мл осевшей активированной CNBr сефарозы смешивают с IgG-фракцией
антител овцы или кролика к IgG человека (специфичных к Fc^) из расчета
100 мг/10 мл с помощью метода, описанного в разд. 9.1.2. Промывают
иммуносорбент PBS (pH 7,2) и используют его с тем же буфером.
10.5. Очистка подклассов IgG человека
Очистка достигается элюцией миеломиого белка из колонки с ДЭАЭ-целлюлозой
в градиенте буфера, как описано в разд. 10.4 для IgA, при использовании в
качестве исходного материала эуглобулииовой фракции.
Примеси иммуноглобулинов других классов или IgG других подклассов удаляют
адсорбцией на колонке с протеин А-сефарозой CL-4B; при этом избирательно
связываются IgGi, IgG2 и IgG4. Подклассы IgG могут быть последовательно
десорбированы в убывающем градиенте pH, начиная с 0,1 М фосфата натрия
(pH 8,0) " затем увеличивая пропорцию 0,1 М лимонной кислоты. IgG3 не
связывается протеином А, и это его свойство может быть использовано для
дальнейшей очистки.
10.6. Очистка подклассов IgG мыши
10.6.1. Использование протеина А и нормальной сыворотки
До начала использования моноклональных антител разделение подклассов IgG
независимо от требуемой степени чистоты оставалось трудной задачей.
Методика очистки заключается в следующем [11]:
1. Уравновешивают колонку с протеин А-сефарозой CL-4B 0,1 М иатрий-
фосфатным буфером (pH 8,0). Доводят pH мышиной сыворотки до 8,0 с помощью
2М трис-основания; добавляют равный объем фосфатного буфера, наносят
смесь на колонку и медленно элюируют фосфатным буфером (5 мл/ч). Элюат
содержит IgG3, который в значительной сте'пеии загрязнен сывороточными
белками, включая IgM и IgA. Для дальнейшей очистки IgG3 необходим
им>муносорбент с антителами к IgG, но выход при элюции в кислой среде
невелик.
2. Элюируют IgGi из колонки с протеином А, используя цитратно-натриевый
буфер (pH 6,0).
3. Элюируют IgG2a, уменьшая цитратиым буфером pH до 4,5.
110
Глава 2
4. Наконец, элюируют IgG2b при pH 3,5; кислые фракции переводят в
нейтральный буфер высокой емкости и диализуют против PBS (pH 7,2).
5. Другой опособ очистки IgG2a- элюция диализованной эуглобулиновой
фракции из колонки ДЭАЭ-целлюлозы в градиенте молярности фосфатного
буфера, которую проводят,, как описано в разд. 10.4.2,
10.6.2. Моноклинальные антитела как источник подклассов IgG
Использование моноклональных антител, выделенных из-асцитной жидкости или
культуральной среды, существенно облегчает получение подклассов IgG мыши.
Значительно более-высокая концентрация Ig определенного изотипа в
сочетании с гомогенностью белка позволяет с помощью протеина А получать
иммуноглобулины высокой чистоты.
Смесь подклассов IgG (за исключением IgGs) может быть, получена на
колонке с протеином А при низком pH в один, этап.
Доступность моноклональных антител в достаточно больших количествах
позволяет использовать другой метод очистки подклассов IgG (так же как
IgM, IgA и. IgE)-аффинную хроматографию на колонках с иммуносорбентом.
Процедуры аффинного связывания и элюции рассмотрены в гл. 5.
1. Связывают антиген с сефарозой 4В, как описано ранее-(разд. 9.1.2), и
приготавливают колонку с PBS (pH 7,2).
2. Эуглобулиновую фракцию асцитной жидкости получают с помощью сульфата
аммония и диализуют ее против PBS-(или диализуют непосредственно
культуральную среду).
3. Наносят антитела на колонку и элюируют несвязав-шиеся белки с помощью
PBS (20 мл/ч) пока светопоглоще-ние при 280 нм не достигнет нижнего
уровня.
4. Элюируют антитела щелочным раствором тиоцианата калия (0,5 М NH4OH,
содержащим 3 М KCNS) из расчета 2 мл на 1 мл объема колонки. Промывают
колонку PBS и немедленно диализуют антитела против PBS.
10.7. Получение Fc-фрагментов IgG человека для иммунизации
1. Раствор очищенного IgG (10 мг/мл) диализуют против 0,1 М фосфатного
буфера, pH 7,0 (см. разд. 10.1).
2. Добавляют хлористоводородный цистеин (1 мг/10 мг IgG) и ЭДТА (0,5
мг/10 мг IgG), затем папаин (1 мг/10 мг IgG). Инкубируют амесь в течение
4 ч при 37 °С.
Получение поликлональных антител и контроль их качества_________jJJ
3. Проводят ИЭФ (гл. 6), используя антисыворотку к целым молекулам IgG
для определения степени гидролиза и наличия Fc-фрагментов, которые
смещаются к аноду относительно интактной молекулы и образуют с ней
перекрещивающиеся дуги.
4. Когда протеолиз в значительной степени завершен (IgG3>lgGi<IgG4<IgG2),
замораживают продукт для прекращения дальнейшего расщепления, а затем
диализуют при 4°С против 0,01 М фосфатного буфера, pH 8,0.
5. Уравновешивают ДЭАЭ-целлюлозу (ДЭ-52) 0,01 М фосфатным буфером и
приготавливают колонку. Наносят расщепленный иммуноглобулин на колонку и
проводят элюцию в градиенте фоофатного буфера (0,01 М- 0,3 М, pH 8,0).
6. Первый пик - Fab-фрашенты (их целесообразно использовать для
абсорбции), второй пик - главным образом Fc-фрагменты с небольшими
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed