Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
10.2. Очистка IgG овцы, быка, козы и кролика
Принцип метода .тот же, что и для IgG человека, но мо-лярность и pH
фосфатного буфера должны быть изменены: для овцы и козы - 0,03 М, pH 7,2;
для IgG кролика - 0,02 М, pH 7,2; для IgG быка - 0,075 М, pH 6,4.
Для повседневного выделения .фракции IgG из больших объемов антисыворотки
рекомендуется одноступенчатый метод очистки диализованной сыворотки на
ДЭАЭщеллюлозе.
Получение поликлональных антител н контроль нх качества
107
При этом достигается степень очистки, достаточная для большинства целей,
"роме иммунизации. Увеличение объемов сыворотки и анионообменника
существенно не сказывается на степени очистки и ..общем выходе
иммуноглобулина. Для успешного проведения процедуры выделения IgG
необходимы антитела к цельной сыворотке соответствующих видор животных и
контрольные антитела ,к IgG.
10.3. Очистка IgM человека
Невозможно полностью очистить IgM с помощью одной хроматографии,
поскольку заряд и размеры этого иммуноглобулина совпадают ? параметрами
других сывороточных белков. Наиболее легкий способ очистки -
использование в качестве исходного материала сывороток пациентов,
страдающих макроглобулинемией Вальденстрёма, которая характеризуется
повышенной продукцией IgM. Можно использовать в качестве исходного
материала преципитат эуглобулиновой фракции нормальной сыворотки <в
.кислом буфере с низкой ионной силой. Это приводит к контаминации
плазминогеном и компонентами комплемента. Далее проводят гель-фильтраци-
онную хроматографию. Джонстон и Торп [11] рекомендуют для получения
зуглобулиновой фракции сыворотки крови больных макроглобулинемией (в
случае когда буфер с низкой ионной силой не позволяет получить
преципитат) использовать 6%-ный (вес на объем) ПЭГ (мол. масса 6000) в
физиологическом растворе, содержащем трис-буфер, pH 8,0.
10.3.1. Получение эугпобупиновой фракции
1. Диализуют сыворотку против 10 объемов 2 мМ фосфатного буфера ('pH 6,0,
4°С), меняя его несколько раз.
2. Дважды отмывают прециПитат тем же буфером, затем растворяют его при
комнатной температуре в 0,15 М физиологическом растворе, содержащем 0,01
М трис-HCl буфер (pH 7,3) в объеме исходной сыворотки больного
макроглобулинемией (Пли около 7ю изначального объема нормальной
сыворотки). Центрифугируют (6000 об/мин) для удаления нерастворимого
материала.
10.3.2. Гепь-фипьтрация
1. Приготавливают при комнатной температуре ,колонку диаметром 2,5 см
с сефакрилом S300 (све'рхмелким, Pharmacia) в физиологическом растворе,
содержащем трис-HCl буфер, из расчета 100 мл геля на 2 мл сыворотки или
эуглобу-
108
Глава 2
лина. Уплотняют гель при скорости потока 200 мл/ч при гидростатическом
давлении не менее 200 см. Необходима колонка с клапанной системой,
обеспечивающей поддержание давления и одновременное введение шприцем
порций очищаемого материала.
2. После уплотнения геля, удалив воздух, смешивают порцию сыворотки с
голубым декстраном, помещают его в колонку и производят разделение при
несколько меньшем давлении, г 3. Собирают элюат порциям,и по 5 мл,
вымывая IgM с 'красящей меткой. Вместо сефакрила S300 можно использовать
сефарозу 4В или 6В или сефакрил S200.
4. Концентрируют IgM до 1 мг/мл с "помощью вакуумного диализа против
PBS и хранят при 4°С во избежание преципитации. Из 1 мл нормальной
сыворотки можно получить около 0,5 мг IgM (из сыворотки больного
макроглобулинеми-ей- приблизительно в 10 раз больше).
10.4. Очистка IgA, IgD и IgE челссока
Исходным материалом для ,очистки служит сыворотка больного миеломой.
Предпочтительно отобрать образцы, в которых соответствующий изотип
миеломного белка .при ИЭФ медленно перемещается к катоду, "поскольку
окончательной очистки достигают адсорбцией и элюцией из анионообменни-ка
в буферном ,градиенте. Иммуноглобулины с низкой подвижностью при элюции в
меньшей степени загрязнены молекулами, мигрирующими в ^-области. Для
выделения IgD необходима е-аминокапроновая кислота ,(1 мг/мл) для
предотвращения энзиматического .расщепления Ig данного изоти-.па,
чувствительного к действию ферментов.
1. Получают эуглобулиновую фракцию из сыворотки больного миеломой путем
преципитации сульфатом аммония, как описано в разд. 10.1.2, п. 1.
2. Диализуют эуглобулин против 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,2) и
наносят на колонку р ДЭАЭ-целлюлозой, •уравновешенную этим же буфером.
3. Элюируют данный изотип Ig в градиенте фосфатного буфера (pH ,7,2) от
0,01 М к 0,1 М.
4. Удаляют примесь IgG из элюированной в градиенте фракции на колонке с
протеин А-сефарозой CL-4B (Pharmacia). При этом связываются все молекулы
IgG, за исключением подкласса IgG3. Маловероятно, что антитела данного
под-жласса существенно загрязняют получаемый иммуноглобулин, Поскольку
представляют собой лишь незначительную ' часть молекул IgG в нормальной
сыворотке. В сыворотке больного, содержащей миеломные IgA, IgD или IgE,
его содержа-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
