Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 42

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 122 >> Следующая

Джонса) или Е'<аь)2-фрагментами, полученными путем расщепления IgG
пепсином.
Рис. 2.9. Применение ELISA для тестирования специфичности антисыворотки к
IgG человека. В лунках панели адсорбирован антиген (2,5 мкг/мл): ряды А и
В -IgG человека, С и D -IgM человека, Е и F -IgA человека (все антигены
получены из нормальной сыворотки); G и Н -легкие цепи к. Исследуемая
сыворотка добавлена в двукратных последовательных разведениях (начиная с
1 : 100) от вертикального ряда 2 до ряда 12 (ряды А и В) или до
вертикального ряда 9 (другие горизонтальные ряды). Лунки вертикальных
рядов 10-12 (ряды С-Н) содержат разведения антисывороток, специфичных к
адсорбированным на дне этих лунок антигенам. В реакции использовали
конъюгат пероксидазы хрена с кроличьей антисывороткой к IgG овцы.
Вертикальный ряд 1-контроль (только конъюгат). Исследуемая антисыворотка
взаимодействует только с IgG человека. Реакция в лунках рядов G и Н идет
вследствие примеси IgG, обнаруженной в препаратах к-цеси, т. е. метод
позволил определить и чистоту антигена
2. Абсорбируют очищенными миеломными белками - IgM и (или) IgA. Если в их
состав входят %- и A-цепи, то этап 1 можно опустить.
3. При получении видосцецифической сыворотки для абсорбции используют
полимеризованную смесь сывороток или колонку с IgG соответствующих видов
животных.
II. Антисыворотки к IgA и IgM человека. Аитисыворотки получают,
иммунизируя животных интактными молекулами,
Получение поликлональных антител и контроль их качества
103
поскольку Fc-фрапменты приготовить трудно, в то время как абсорбция с
помощью IgG |(для удаления антител к у- и легким цепям) не вызывает
затруднений. Для получения IgM и IgA используют миеломные белки, причем
Ig одного изотипа легко очистить от примесей другого, поскольку они
сильно отличаются по мол. массе. Примеси IgG удаляют на колонке с протеин
А-сефарозой (разд. 10.4.4). Для получения изотйп-специфической сыворотки
для абсорбции используют IgG в комплексе с IgA и IgM и дополнительные
легкие цепи.
Целесообразно полимеризо-вать сыворотку крови пуповины, которая богата
IgG, но не содержит IgA и IgM.
Для получения видоспецифической сыворотки используют солевые преципитаты
эу-глобулиновой фракции сывороток соответствующих видов животных.
Тестирование исходной и абсорбированной сывороток к человеческому IgM
методом ИЭФ показан на рис. 2.10.
III. Антисыворотка К Jiod- сти антисыворотки к IgM человека л ~ до
и после абсорбции иммуноглобу-
линами других классов (иммуноэлектрофорез). В лунки внесены:
(a) нормальная сыворотка человека,
(b) очищенный IgM. В канавки вне-
Рис. 2.10. Определение специфично-
классам IgG человека. Соот ветствующие антисыворотки получают, используя
для иммунизации Fc-фрагменты или целые молекулы миеломного сены: (1)
антисыворотка к цельной IgG определенного подкласса. сыворотке человека,
(2) неабсорби-
Абсорбцию проводят, как они- анГыГрГа'
сано в пп. 1 и 2 подраздела I, после абсорбции с помощью IgG и а затем
путем нанесения сыворотки на колонку с соответствующими подклассами.
Многие животные отвечают без адекватного распознавания подклассов, а если
такое распознавание наблюдается, то сыворотки тем не менее требуют
тщательной абсорбции. Очень трудно получить антисыворотки, которые
распознавали бы все подклассы миеломных белков без перекрестных реакций.
Для иммунизации важен выбор вида животного. Показано, что для этих целей
целесообразно использовать птиц ввиду их филогенетической отдаленности.
IgA. В результате абсорбции получен специфический реагент по крайней мере
по данным иммуноэлектрофореза
104
Глава 2
Наиболее эффективный метод получения антител к подклассам IgG человека
основан на гибридомной технологии [24, 50].
IV. Антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и крысы. Для общих целей анти-
IgG получают путем иммунизации животных фракцией IgG, полученной в
результате аффинной очистки на колонке с протеинА-сефарозой (разд.
10.6.1). Для удаления антител к другим классам иммуноглобулинов сыворотки
сорбируют моноклональными антителами или сывороткой, лишенной IgG.
Анти-IgM сыворотку можно получить, вводя животному антиэритроцитарные
гомологичные IgM в виде комплекса IgM-эритроциты; сыворотку абсорбируют
суспензией эритроцитов, нагруженных IgG (см. разд. 9.1.4, подраздел IV).
' Для проверки специфичности, как правило, используют реакцию диффузии в
геле по Ухтерлонн, но чаще РПГА, ELISA или ИРМА с помощью .панели МКА
всех изотипов.
Антисыворотки к подклассам IgA и IgG могут быть получены с помощью
гибридомной технологии. Готовые к применению аффинно очищенные антитела
могут быть использованы как в качестве иммуногенов, так и в качестве
сорбирующих антигенов. При этом простота в определении изотипов
•моноклональных антител сочетается с возможностью успешного получения
специфической преципитирующей антисыворотки. Сыворотки получают, вводя
животному интактные молекулы Ig или Fc-фрагменты, затем их истощают на
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed