Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 41

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 122 >> Следующая

раствора в 0,15 М физиологическом растворе. Добавляют 1 мл раствора белка
в 0,15 М физиологиче-еком растворе. Обычно используют 1 мг/мл белка, но
можно попробовать применить и более высокие концентрации.
7*
100
Глава 2
1 3. 2 мл плотного осадка эритроцитов добавляют к полу-
ченной смеси, закрывают сосуд и перемешивают вращением при комнатной
температуре в течение ночи.
4. Отмывают клетки в физиологическом растворе. После этого они могут
быть использованы для абсорбции антител. Количество эритроцитов,
нагруженных белком, должно соответствовать конкретным задачам.
II. Метод, основанный на использовании глутарового альдегида \49\.
1. Отмывают эритроциты барана стерильным физиологическим раствором и
центрифугируют для получения плотного осадка.
2. На каждые 0,4 мл осадка эритроцитов добавляют 0,4 мл физиологического
раствора, содержащего 10-20 мг белка, закрывают крышкой и встряхивают.
3. Добавляют 2,5%-ный раствор глутарового альдегида. Как правило,
достаточно 0,5 мл, но в зависимости от белка количество может быть
увеличено до 2 мл.
4. Перемешивают смесь вращением в течение 1 ч при комнатной температуре;
перед использованием промывают клетки в избытке физиологического
раствора.
III. Метод, основанный на использовании танниновой кислоты- см. разд.
6.3.2.
IV. Нагруженные антителами эритроциты в качестве иммуносорбентов.
Эритроциты, нагруженные очищенными анти-эритроцитарными иммуноглобулинами
определенного изотипа и стабилизированные глутаровым альдегидом,
позволяют достаточно просто сорбировать антиглобулины для достижения
требуемой изотипспецифичности. В качестве примера приведем методику
связывания эритроцитов с IgM: 1
1. Отмывают эритроциты барана PBS и добавляют 1%-нук> суспензию ('по
объему) к 5 мл кроличьего антиэритроцитар-ного IgM (см. разд. 3.2.3).
2. Перемешивают суспензию клеток вращением при 37 °С в течение 45 мин,
затем отмывают их 6 раз PBS, тщательно диспергируя агрегаты клеток.
3. Осадок отмытых клеток суспендируют в PBS для получения 1%-ной (объем
на объем) суспензии и инкубируют е 4% глутарового альдегида в течение
часа при комнатной температуре при ротационном перемешивании.
Непосредственно перед использованием клетки тщательно отмывают.
V. Абсорбция сывороток эритроцитами. 1%-ную суспензию нагруженных
эритроцитов смешивают с равным объемом сво-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
101
бодной от комплемента сыворотки и перемешивают вращением в течение 1 ч
при комнатной температуре в закрытом флаконе. Истощенную сыворотку затем
собирают центрифугированием. Остаточную активность антител удобно
проверить методом ге-магглютинации. Для этого используют эритроциты,
нагруженные аналогичным способом, правда, продолжительность реакции
связывания белка и концентрацию последнего, возможно, придется изменить.
При необходимости абсорбция может быть повторена с помощью новых порций
эритроцитов.
9.1.5. Абсорбция сывороток бактериальными суспензиями
Бактерии, взятые в логарифмической фазе роста в концентрации около 108
клеток/мл, инактивируют подходящим способом, отмывают от культуральной
среды и центрифугируют. Инактивированная нагреванием антисыворотка может
быть сорбирована неоднократно. При этом каждый раз используют 108
микробных клеток и ресуспендируют их в 1 мл сыворотки путем перемешивания
при вращении в течение 1 ч при комнатной температуре. Так, например,
трехкратная абсорбция кроличьей антисыворотки к С. jejuni каждой из
восьми суспензий других гра'мотрицательных микроорганизмов кишечника
позволила .получить антиаыворотку к Campylobacter spp. с титром,
превышающим 1:12 800 (по данным иммуноферментного анализа).
9.1.6. Абсорбция актиглобуликовых сывороток
Специфичность антиглобулинов является критическим моментом во многих
иммунологических исследованиях. Антигены-иммуноглобулины дают
перекрестную реакцию между изо-тйпами и видами, поэтому чтобы добиться
специфичности антисыворотки к иммуноглобулину данного вида, класса и
подкласса, необходима тща'тельная абсорбция. Одна из наиболее
распространенных ошибок начинающих исследователей - это представление о
том, что антисыворотка, специфичная, например, к IgG кролика (т. е. не
связывающаяся с кроличьим IgM или IgA), не будет взаимодействовать с IgG
других видов. Чаще всего такое взаимодействие будет наблюдаться, если
сыворотка не была истощена IgG этих видов.
I. Ангисываратка к IgG человека. Лучше всего получить такую сыворотку
путем иммунизации Fc-фрагментами IgG, выделенного из сыворотки (разд.
10). Из-за некоторой примеси Fab-фрагмен'тов в сыворотках обычно
содержатся антитела и к легким цепям, которые связываются со всеми
классами
102
Глава 2
иммуноглобулинов, а также антитела к общим эпитопам тяжелых цепей. Пример
тестирования специфичности антиоы-воротки к IgG человека с помощью
иммуноферментного метода представлен на рис. 2.9.
1. Абсорбирую^ сыворотку смесью к- и Я-цепей (очищенный белок Бене -
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed