Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 40

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 122 >> Следующая

PBS, pH 7,4.
5. Блокируют оставшиеся участки связывания добавлением 1%-ного (вес на
объем) раствора БСА в PBS в объеме, равном объему геля; реакцию проводят
в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С.
Промывают гель, как указано в п. 4.
6. Для абсорбции неразведенной сыворотки ее соединяют с сорбирующим
полимером в равных объемах и перемешивают (лучше вращением) при комнатной
температуре в течение нескольких часов. Истощенная сы.'воротка может быть
отделена центрифугированием. i
7. Иммуносорбент может быть очищен от связавшихся антител и использован
повторно. Для восстановления свойств сорбента его промывают в большом
количестве 0,1 М глицин-HCl буфера, pH 3,2, для диссоциации антител, а
затем - PBS до тех пор, пока pH элюата не достигнет 7,2-7,4, а оптическая
плотность при 280 нм не станет минимальной и
7-997
98
Глава 2
близкой к оптической плотности чистого PBS. Промытый сорбент можно
хранить при 4°С с добавлением 1% (вес на объем) азида нат'рия.
9.1.2. Колонки с антигеном, иммобилизоввнном нв сефарозе
Сефарозу 4В (Pharmacia) можно активировать CNBr (бромистым цианом) для
придания ей способности к связыванию белков. Активированную сефарозу
поставляют многие фирмы (например, Pharmacia), и в этом случае работу
начинают с этапа 4 (см. ниже). !
1. Отвешивают 2 г твердого CNBr в вытяжном шкафу. Внимание: CNBr
токсичен, и этапы (2) и (4) следует тоже проводить в вытяжном шкафу. '
2. Разводят 20 г сефарозы 4В в 50 мл дистиллированной воды и добавляют
CNBr при перемешивании. Доводят pH до 11 с помощью 2 М NaOH и
поддерживают его на этом уровне в течение следующих 10 мин.
3. Фильтруют активированные гранулы через воронку со стеклянным фильтром
и промывают холодной дистиллированной водой, а затем - 0,1 М ИаНСОз.
4. Промывают гранулы в стеклянной мензурке на 200 мл тем же буфером и
дают им осесть. Удаляют супернатант.
5. Растворяют 250-300 мг сорбирующего белка в 60 мл 0,1 М NaHC03,
диализуют его и добавляют к гранулам. Перемешивают 12-16 ч при 4°С в
закрытой мензурке или в ротационном смесителе, затем промывают большим
количеством дистиллированной воды, PBS, 0,5 М уксусной кислотой и,
наконец, снова PBS до тех пор, пока оптическая плотность не будет
соответствовать таковой чистого PBS. Сорбент можно хранить при 4°С с 0,1%
(вес на объем) азида натрия.
6. Помещают подходящее количество сорбента в колонку,, используя в
качестве буфера PBS: на 10 мл сорбируемой сы-,воротки берут 2 г исходной
сефарозы. Пропускают сыворот-,ку сверху вниз через колонку со скоростью
не более 6 мл в час. Следят по о'птичес'кой плотности за пиком
сорбируемого белка в элюате.
7. В перерыве между сорбциями отмывают колонку от связавшихся антител,
как описано в;разд. 9.1.1. %
9.1.3. Колонки с антигеном, иммобилизоввнном нв карбонате целлюлозы
Микрокристаллический транс-2,3-карбонат целлюлозы выпускает фирма Sigma.
Он обладает рядом свойств, позволяющих рекомендовать его в качестве
матрикса для сорбента.
Получение поликлональных антител и контроль их качества_________99
.Карбонат целлюлозы связывает около 40 мг белка (например, IgG) на .1 г
целлюлозы при мягких условиях, исключающих денатурацию; в результате на
его основе удается приготовить стабильный иммуносорбент с сильной
связывающей активностью. Методика получения сорбента заключается в
следующем [46]:
1. 100 мг сорбирующего антигена растворяют в 20 мл Ю,1 М фосфатного
буфера (pH 6,8). Добавляют при переме-Щивании 1,6 г карбоната целлюлозы.
Перемешивают смесь йращением при комнатной температуре в течение 24 ч.
2. Отмывают сорбент центрифугированием с 10 мл PBS '(pH 7,4) четыре раза,
ресуспендируют в 15 мл PBS и помещают в колонку (9X1 см) над 2-мл слоем
сефадекса G25. При использовании в качестве сорбента IgG удается связать
60- 70% белка.
3. Пропускают через колонку PBS со скоростью 10 мл в 'час до стабилизации
оптической ллотности при 280 нм на 'нижнем уровне. Через колонку может
быть пропущено до 60 мл оыворотки.
4. Колонку можно восстановить для последующего использования отмыванием,
как описано выше.
9.1.4. Абсорбция с использованием эритроцитов
Весьма удобный и простой метод удаления нежелательных антител из
сывороток заключается в использовании эритроцитов, на поверхности которых
присоединены или адсорбированы .перекрестно реагирующие или примесные
антигены, входящие в состав иммуногена. Перед абсорбцией сыворотка должна
быть предварительно инактивирована нагреванием до 66 °С в течение 30 мин
для ..потери способности к комплемент-'зависимому лизису.
Процесс связывания может быть индуцирован применением таких веществ, как
хлорный хром, глутаровый альдегид или танниновая кислота.
1. Метод, основанный на использовании хлорного хрома 147, 48].
1. Трижды отмывают эритроциты барана стерильным физиологическим раствором
и центрифугируют для получения ^плотного осадка.
2. Из концентрированного раствора хлорного хрома гото-)вят 1 мл 0,1%-ного
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed