Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 39

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 122 >> Следующая

кислоты или хлорида хрома. Углеводы адсорбируют пассивно. ИЭФ/двумерный
ИЭФ: так же, как для смеси антигенов.
ИФА: определяют предельный титр к различным бактериальным экстрактам и
очищенным антигенам (кн. 2).
ОРИД: используют очищенные антигены (ЛПС, полисахариды и т. п.) в
агарозе. Сравнивают с контрольными сыворотками к ЛПС и т. п. (рис. 2.8)
Метод бактериальной агглютинации. Иммунофлуоресценция: метод разведений с
меченым антиглобулином.
Другие тесты--как для экстрактов, особенно для
Прямая гемагглютинация.
РСК: общий титр IgM и IgG необработанной сыворотки, титр IgG после
обработки 2-меркаптоэта-нолом (гл. 7).
ИЭФ: определяют число дуг преципитации со стандартной смесью антигенов и
сравнивают с контрольной антисывороткой (рис. 2.10). Двумерный ИЭФ:
аналогично ИЭФ (рис. 2.7). Вестерн-блоттинг: сравнивают профиль
связывания исследуемой и нормальной сывороток со стандартным антигеном.
Используют маркеры мол. массы для определения специфичности антител (см.
гл. 6).
ИЭФ/двумерный ИЭФ: как для смеси антигенов. ELISA/ИРМА: проверяют
антнсыворотку по отношению к (1) иммуногену, (2) другим экстрактам тех же
бактерий, (3) антигенам других линий, серотипов и видов.
Вестерн-блоттинг: определяют перекрестно реагирующие антигены других
бактерий с целью абсорбции (см. гл. 6).
Бактериальная агглютинация и иммунофлуоресценция: используют интактные
клетки того же или родственного штамма, вида и т. п. газделенных
поверхностных молекул.
Для эритроцитов барана применяют редко, но можно использовать эритроциты
других видов. Типирование эритроцитарных антигенов человеку (кн. 2).
Продолжение табл. 2.S
Нммуногеп Определение титра Проверка специфичности
Суспензии других клеток Иммунофлуоресценция и иммунофермеитные
методы: прямые или с использованием меченого антиглобулина (кн. 2).
Комплемент-зависимая цитотоксичность с использованием красителя или 51Сг.
Иммупофлуоресценция: лучше - с использованием клеточного сортера.
Антисыворотку проверяют на способность тормозить связывание меченого
контрольного конъюгата (кн. 2).
Антигены в тканях
Аллотипы иммуноглобулинов
Идиотины иммуноглобулинов
Специфичность на гистологических срезах определяют: (1) путем
использования стандартных анти-ген-познтивных и негативных тканей или
клеток, (2) предварительным истощением чистым антигеном или антигеп-
познтнвпыми клетками, (3) блокированием специфического связывания
предварительной обработкой срезов немеченой контрольной сывороткой перед
применением исследуемой меченой (кн. 2).
Наличие аллотипов зависит от меиделевского наследования аллелей в
аллотипическнх локусах, экспрессируемых как кодомииантные антигенные
маркеры. Новые типирующис сыворотки требуют сравнения с контрольными
реагентами по отношению к стандартным антигенам. Некоторые локусы у
кролика могут быть типированы с помощью преципитирующих сывороток методом
Ухтерлони. Другие требуют постановки специфической РПГА или РИА. У мышей
аллели различных изотипов экспрессированы у разных ппбредиых линий. Они
выявляются с помощью РИА [52, 53].
В случае специфичности к идиотипу связывание ограничено только молекулой
антитела, вызвавшего ответ, аитисыворотка не связывается с другими
антителами. Обычно источником идиотипического иммуиогена (и тест-
антигена) служат гомологичные, аффинно очищенные антитела (к углеводам),
миеломный белок или (у мышей, крыс, человека) моноклональные антитела.
Реакцию идиотип-анти-ндиотип (и титры сывороток) проверяют методом
Ухтерлони, ПГА (эритроциты, нагруженные идио-типом), ELISA/ИРМА или РИА.
Получение поликлональных антител и контроль их качества
97
грубым денатурирующим воздействием, которые сопровождают диссоциацию
связавшихся антител при аффинной очистке. Более того, последние методы
дают меньший выход антител, и обычно сохраняют активность лишь антитела
самой низкой аффинности (наиболее легко диссоциирующие).
Абсорбция должна проводиться на твердой фазе, что требует химического
соединения (или пассивного связывания) адсорбирующих антигенов с
нерастворимой основой (например, с дериватами целлюлозы, полистиролом,
эритроцитами, и т. д.) или получения геля из перекрестно-связанного
антигена. Получение и использование наиболее часто применяемых
иммуносорбентов приведены ниже.
9.1.1. Перекрестное связывание сорбирующих белков глутаровым
вльдегидом
1. Приготавливают раствор белка (250 мг в 5 мл фосфатного буфера, pH
7,0). Это может быть белковый антиген, или, если его мало, смесь антигена
с сывороточным альбумином. Диализуют раствор против фосфатного буфера и
проверяют pH.
2. Добавляют по каплям 1-2 мл 2,5%-ного раствора глутарового альдегида в
воде 'при перемешивании до начала образования геля, нейтрализуя его при
необходимости NaOH.
I 3. Выдерживают гель при .комнатной температуре 3 ч и затем разрушают
его до образования мелких частиц.
4. Промывают пель большим количеством воды, а затем 0,2 М фосфатным
буфером, pH 7,4; 0,1 М глицин-HCl буфером, pH 3,2, далее несколько раз
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed