Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 38

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 122 >> Следующая

антигенов, требуют предварительного удаления антител с нежелательной
специфичностью. Это неизбежно при использовании даже самого чистого
иммуногена, если у него есть общие эпитопы с родственными молекулами,
находящимися в исследуемом образце. Эта проблема особен-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
93
но актуальна при определении гормонов. Кроме того, обычно сыворотка
содержит антитела к контаминирующим молекулам, находящимся в инъецируемой
смеси, которые могут присутствовать в исследуемых образцах. Аффинная
очистка на колонке с антигеном может в ряде случаев оказаться полезной
(увеличить концентрацию, эффективность мечения антител, снизить фон), но
не оказать влияния на специфичность ¦ по изложенным выше причинам. Данный
метод не позволит *¦
Рис. 2.8. Реакция обратной радиальной иммунодиффузни, используемая для'
сравнения титра и прецнпнтирующих свойств антисыворотки к IgG человека
(два нижних ряда) с контрольной антнсывороткой (два верхних ряда).
Сравнивая размеры колец преципитации, можно видеть, что исследуемая
сыворотка содержит на 50% меньше антител, чем контрольная. 9,8 мл 1%-иой
агарозы содержат 10 мкл цельной нормальной сыворотки человека и 3% (вес
на объем) ПЭГ. Сыворотка разведена (слева направо) 1:2, 1:4, 1:8, 1 : 16
и 1 : 32. Лунки содержат по 5 мкл антнсывороткн к IgG. Пластину
инкубировали при комнатной температуре в течение 24 ч
решить проблему до тех пор, пока не будет выделена эпитоп-
рестриктированная антигенспецифическая субъединица или пептид. Для
большинства целей абсорбция антисыворотки представляет собой наиболее
практичный метод решения проблемы, если уже известны перекрестно
реагирующие антигены и .примеси. Главное преимущество абсорбции (для
удаления нежелательных антител) заключается в том, что несвя-завшиеся
антитела в ходе процедуры не подвергаются тем
Таблица 2.5. Системы контроля качества аитисывороток
Иммуиоген
Определение титра
Проверка специфичности
Г аптены
Очищенные отдельные макромолекулы
Изотипы иммуноглобулинов
ПГА: эритроциты нагружают гаптеном или гап-теном на носителе.
ELISA/ИРМА: в лунках планшета адсорбируют гаптен, связанный с носителем,
и используют меченый антиглобулнн.
Иммунологический тест с модулированным ферментом: используют гаптеи,
связанный с ферментом.
РИА: применяют радиоактивно меченный гаптен или конъюгат (кн. 2).
Равновесный диализ: анализ аффинности в случае гомогенных антител к
небольшим гаптенам [51].
Метод Ухтерлоии: используют разведения аити-сыворотки в лунках,
расположенных вокруг центральной лунки с антигеном.
Радиальная иммунодиффузня (РИД): антиген,
содержащийся в агарозном геле, взаимодействует с антнсывороткой в луиках.
Сравнивают с контрольной сывороткой (см. рис. 2.8).
ПГА: эритроциты нагружают антигеном.
ELISA/ИРМА в лунках планшета адсорбируют антиген (рис. 2.9).
РИА: используют меченный изотопом антиген.
Количественная реакция преципитации: определяют абсолютное количество
антител в преципитате, полученном при оптимальных соотношениях реагентов
(кн. 2).
Методы контроля те же, что и для других отдельных макромолекул. В
качестве стандарта изотипа Ig человека используют очищенные парапротеииы
(миеломные белки), поликлональные изотипы нормальных сывороток, легкие
цепи к и X белка Бене Джонса н Fc (к)-фрагменты IgG. Стандарты
Метод Ухтерлонн: проверяют антисыворотку по отношению к (1) гомологичному
гаптену и носителю, (2) гаптену н другому носителю, (3) другому гаптену
на том же носителе, конъюгированному с помощью той же химической реакции,
(4) одному носителю (гл. 6).
ELISA/ИРМА: используют (1) - (4) в качестве? антигена (кн. 2).
РИА: используя меченый стандартный антиген, сравнивают кривые связывания
тестируемой и контрольной сывороток (кн. 2).
Метод Ухтерлони: проверяют аитисыворотку по отношению к иммуиогеиу,
стандартному антигену, смеси антигенов, родственным белкам и т. п. ИЭФ:
проверяют антисыворотку к разным антигенам, как в методе Ухтерлонн (рис.
2.10). Двумерный ИЭФ: антисыворотка в агарозе реагирует со смесью
антигенов, выбирают сыворотку, дающую один пнк преципитации (рис. 2.2,5).
ПГА, ELISA/ИРМА: используют нагруженные
антигеном эритроциты нлн луики с адсорбированным антигеном (рнс. 2.9).
Вестерн-блоттинг: ДСН-ЭПАГ позволяет получить отдельные полосы антигенов
смесн, очищенного стандартного аитигеиа, родственных белков и т. п.
Смеси антигенов
Бактериальные
экстракты
Бактериальные
суспензии
Эритроциты
изотипов мыши-это очищенные моноклональные антитела (не антиглобулины).
Миеломные белки можно получить от крыс. В случае других видов изотипы
получают из пула нормальных сывороток.
Важен не столько титр, сколько сбалансированная полиспецифичпость.
ИЭФ: антисыворотка в канавках должна давать хорошие дуги преципитации прн
одном заполнении.
Двумерный ИЭФ: содержание антисыворотки в агарозе должно быть менее 10%.
Следят за балансом высоты пиков (рис. 2.7 и гл. 6).
ПГА: белковыми антигенами покрывают эритроциты с помощью танниновой
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed